[发明专利]一种脲基甲酸水解酶及其制备方法

说明书

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种脲基甲酸水解酶及其制备方法。包括以下步骤：1)利用PCR技术扩增得到脲基甲酸水解酶的克隆，2)构建脲基甲酸水解酶的表达载体；3)将表达载体转化入大肠杆菌感受态菌体中得到重组菌体，进一步诱导表达、和纯化蛋白得到脲基甲酸水解酶。该方法简单，易操作，且发现了新的基因序列的脲基甲酸水解酶，该酶在低温条件下依然具备较强的酶学活性。另外，本发明还提供该脲基甲酸水解酶的多克隆抗体以及其检测方法，对低温菌Cryobacterium属菌种的鉴定提供新的依据，对于脲基甲酸水解酶的研究提供了新的研究方向。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，主要涉及一种脲基甲酸水解酶及其应用。

背景技术

脲基甲酸水解酶，英文名：Allophanate hydrolase。脲基甲酸水解酶在三嗪类除草剂的降解过程中起重要作用，它催化降解脲基甲酸，生成氨气和二氧化碳。对于如阿拉特津除草剂等含有三嗪的污染物具有降解作用，在环境保护领域具有广阔的应用前景。

利用脲基甲酸水解酶降解除草剂污染物的中间体脲基甲酸具有极大的应用前景，在低温条件条件下，以脲基甲酸为底物降解生成氨气，净化环境具有较好的效果。

目前生产得到的脲基甲酸水解酶对低温的耐受能力差，在低温下几乎不能发挥活性，在工业生产上，对温度的要求较高。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种低温适应性好的脲基甲酸水解酶，并相应开发一种更高效、简便的制备脲基甲酸水解酶的方法。

本发明提供一种脲基甲酸水解酶的氨基酸序列，所述脲基甲酸水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供一种脲基甲酸水解酶基因的核苷酸序列，所述脲基甲酸水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

相应地，本发明提供包含上述脲基甲酸水解酶基因的重组载体、重组菌株以及表达上述脲基甲酸水解酶的方法。本发明提供包含上述脲基甲酸水解酶基因的重组载体，优选为pET21a；本发明提供包含上述脲基甲酸水解酶基因PCR扩增的引物序列，正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4；将本发明的脲基甲酸水解酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接，作为本发明的一个优选的实施方案，具体的是将本发明的脲基甲酸水解酶基因插入到质粒pET21a上的EcoRI和NdeI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于启动子下游并受其调控，得到重组大肠杆菌BL21表达质粒pET21a-APH；本发明还提供了一种表达上述脲基甲酸水解酶的方法，包括以下步骤：

1)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脲基甲酸水解酶的编码基因插入到质粒pET21a上的EcoRI和NdeI限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌BL21表达质粒pET21a-APH；

2)将上述重组载体转化大肠杆菌BL21感受态，得到重组菌株Ecoli BL21-pET21a-APH；

3)将Ecoli BL21-pET21a-APH扩大培养，诱导表达脲基甲酸水解酶，收集菌体；

4)菌体破碎后，通过Ni-NTA亲和层析色谱柱纯化后得到纯化的脲基甲酸水解酶。

相应地，本发明提供上述脲基甲酸水解酶鼠来源的多克隆抗体的制备和检测方法，包括以下步骤：

1)纯化后的脲基甲酸水解酶注射小鼠，采集血清；

2)用步骤1)中得到的血清通过ELISA进行抗体对抗原的效价；

3)步骤2)中的测得的效价符合条件，即进行抗体纯化；

4)将步骤3)中纯化得到的抗体与脲基甲酸水解酶的原始菌株的破碎液进行Western Blotting检测。