[发明专利]免疫探针降解PCR层析核酸检测法

说明书

本发明公开了一种免疫探针降解PCR层析核酸检测法，包括扩增和免疫层析检测等步骤。扩增的体系中包括可以随基因扩增而降解的特异性免疫标记探针、不随扩增反应降解的内标探针。将扩增的产物进行免疫层析检测。通过结果判读是否有目的基因存在。本发明提供了一种不依赖昂贵仪器，便于操作特点的基础上，兼顾灵敏性高，稳定性强，不受二聚体、气溶胶等PCR技术自身特点的基因检测方法。特别适用于各领域内基因检测的应用和推广。实用价值高。

技术领域

本发明涉及一种免疫探针降解PCR层析法，具体而言是一种适用于基因快速、可视化检测的方法，属于分子诊断领域，。

背景技术

随着分子生物学的发展，以聚合酶链式反应（PCR）技术为基础的基因诊断得到了广泛的应用，特别在感染性病毒、微生物、肿瘤标志物等检测领域中，起到了越来越重要的作用。

PCR技术的原理是，使用特异性引物，在体外重建的PCR扩增体系中，通过聚合酶使目的基因得到扩增，并通过琼脂糖电泳、荧光实时收集、胶体金免疫层析等方法，对扩增产物进行跟踪，从而达到检测的目的。

目前常用到的PCR核酸检测法有实时荧光定量PCR法、PCR免疫层析法、数字PCR法等。

如公开号为CN105018468A的专利，提出了一种荧光定量PCR试剂盒和方法，使用两端带有免疫发光基团标记的探针，随着扩增的进行，探针上的淬灭基团被降解，另一端标记的荧光基团发光，通过收集和分析荧光信号，从而表征基因的扩增情况。该方法具有精确、高效等优点。但存在着自身的不足，如必须依赖于昂贵的荧光定量PCR检测系统，该系统属于精密仪器，其自带的软件需要专业人员进行操作和判读。另外，鉴于PCR检测法自身的特点，需要比较严格的实验室环境，扩增样本提取、扩增检测等步骤，需要在特定条件的实验室下进行，不利于广泛推广。

再例如，公开号为CN102520172A的专利，提出了一种结合PCR技术和免疫胶体金层析技术的核酸检测方法，使用了地高辛和生物素标记特异性探针，经过PCR反应过程，获得的核酸产物两端带有生物素和地高辛的标记。将扩增产物进行免疫层析试纸检测，试纸上固定地高辛抗体，金颗粒标记生物素抗体。在层析过程中，金颗粒、待测核酸片段和地高辛抗体之间形成三层夹心状结构，并截留于检测线。从而根据检测线的显色，表征是否有目的基因的扩增。该方可以不借住高精密度的仪器，操作简单，检测结果可以肉眼判读。但根据PCR反应自身的特点，该反应体系中的引物二聚体会严重的影响免疫层析结果。并且随着模板和反应循环数的变化，以及非特异性扩增产生的产物，这些都能使检测结果容易出现假阳性。另外，大量的标记扩增产物会随着反应管的打开，散发与空气之中，形成气溶胶，从而导致了胶体金检测结果的不准确。

为了使基因检测在不依赖昂贵仪器，便于操作特点的基础上，兼顾灵敏性高，稳定性强，不受二聚体、气溶胶等PCR技术自身特点的限制。本发明提供了一种免疫探针降解PCR层析核酸检测法。为基因检测领域提供一种高效且可靠的方法，成为检测手段有力的支撑，具有很高的实际应用价值。

发明内容

本发明的目的是：提供一种快速的基因检测方法。以克服传统检测方法耗时长、依赖精密仪器、依赖专业人员、精度低、易受污染等缺点。另外，本发明以内标探针为参照验证检测结果是否正确，在一定程度上能有效避免探针无法完全降解等问题造成的检测问题。从而有效的对检测结果作出科学和准确的判断。

本发明目的的实现：

一种免疫探针降解PCR层析核酸检测法，包括核酸扩增过程和胶体金免疫层析过程。其特征在于。

针对待测基因，设计特异性结合的免疫探针序列，两端分别标记不同的可被抗体特异性识别的分子物质，作为一个实施例，所标记的分子为地高辛和生物素。

同时设计内标探针，该探针是其他源性的寡聚核酸片段，该片段不与待测基因结合，不参与扩增反应。两侧标记可被抗体特异性识别的分子物质。作为一个实施例，所标记的分子为生物素和多巴胺。