[发明专利]重组精氨酸脱亚胺酶及其产业化制备方法和应用

权利要求书

1.一种编码精氨酸脱亚胺酶的基因，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

2.含有权利要求1所述编码精氨酸脱亚胺酶的基因的载体，所述的载体为pET21b或者pET28a。

3.包含权利要求2所述载体的大肠杆菌菌株，所述大肠杆菌菌株为BL21(DE3)、BL21(DE3)plys或Rosetta（DE3）。

4.一种精氨酸脱亚胺酶的重组制备方法，所述方法包含下述步骤：

将如权利要求3所述的大肠杆菌菌株的二级种子液按照5-15%的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基发酵罐中，发酵接种之前加入1/1000（V/V）的微量元素母液；所述分批发酵培养基组成及含量：一水合柠檬酸0.5-3 g/L，磷酸二氢钾8-15 g/L，磷酸氢二铵3-7g/L，葡萄糖10-20 g/L，七水合硫酸镁1.5-3 g/L；所述微量元素母液组成及含量：FeSO₄.7H₂O 10 g/L、ZnSO₄.7H₂O 2.25 g/L、CuSO₄.5H₂O 15 g/L、MnSO₄.5H₂O 5 g/L、CaCl₂.7H₂O 1 g/L、CoCl.6H₂O 1 g/L、Na₂MoO₄.2H₂O 1.125 g/L、H₃BO₃ 0.0625 g/L、HCl41.75 mL、Biotin 0.5 g/L;

设定发酵温度为37℃、pH为6.8-7.2之间、DO设定在35-40%之间；

发酵开始后定期取样进行OD₆₀₀和菌体湿重的测定，待DO曲线出现急剧上升的时候，开始加入补料培养基进行补料培养，补料开始之前加入1/1000（V/V）的微量元素母液；所述补料培养基组成及含量：甘油1024g/L，七水合硫酸镁10-20g/L；补料培养基的流加速度维持在25-30g/h;

待菌体生长至OD₆₀₀为45-55之间向发酵罐中加入终浓度为0.2-1.0mM/L的IPTG进行诱导表达；37℃诱导表达4-6h结束培养；

诱导表达培养结束后还包括精氨酸脱亚胺酶包涵体变性前预纯化，包括如下步骤：（1）诱导表达结束后的菌体使用缓冲液Buffer A充分重悬至菌体浓度为100g/L，室温搅拌1.5h；

离心破碎；（2）菌体破碎后收集的精氨酸脱亚胺酶包涵体固体颗粒分别使用bufferB、bufferC、去离子水重悬，离心收集包涵体沉淀，即得到预纯化后的精氨酸脱亚胺酶包涵体；所述Buffer A组成及含量:50mM Tris-HCl，1mM EDTA，100mM 氯化钠，1mM PMSF，0.5mg/ml溶菌酶，pH=8.0;所述bufferB组成及含量：20-100mM Tris-HCl， 0.5-5mM EDTA，100-300mMNaCl，1mM PMSF, 0.5-2% TritonX-100，pH=8.0；所述bufferC组成及含量：20-100mM Tris-HCl，0.5-5mM EDTA，0.1-0.3M NaCl，1mM PMSF，0.5-2% TritonX-100，1.5-4M脲，pH=8.0；

预纯化结束后还包括精氨酸脱亚胺酶包涵体变性，变性液buffer D组成及含量：8-10M脲，20-50mM Tris-HCl，8-10mM DTT，0-1mM EDTA，pH 10.0；以及精氨酸脱亚胺酶包涵体复性，复性缓冲液buffer E组成及含量：8-12mM PB，0-1mM EDTA，0-10mM DTT，pH 7.2。

5.权利要求4所述的精氨酸脱亚胺酶的重组制备方法，还包括精氨酸脱亚胺酶包涵体复性后样品的纯化，所述纯化方法是使用离子交换层析及疏水层析两步纯化法。