[发明专利]盐酸苄丝肼在制备PCSK9抑制剂中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及盐酸苄丝肼在制备PCSK9抑制剂中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

动脉粥样硬化(AS)是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要原因。脂质代谢障碍是动脉粥样硬化的病变基础，其中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)是致动脉粥样硬化心血管疾病最重要的危险因素，有研究者提出，降低LDL-C应作为治疗AS的主要目标。血浆中LDL-C主要经LDL受体(LDLR)内化代谢，在肝脏转化成胆汁酸或直接经胆管排出，是体内清除血浆LDL-C的最主要的去路.临床针对血脂异常的防治除饮食治疗和改善生活方式之外，还采用药物进行调脂治疗。他汀通过竞争性抑制细胞内胆固醇合成，已成为降血脂的首选药物。研究表明，他汀类通过调节LDLR表达增高，降低血浆LDL-C水平，但同时也升高了介导LDLR溶酶体降解作用的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9型(PCSK9)的表达，使他汀类药物单用大剂量降脂作用受限，寻求以PCSK9为作用靶点的药物，将为进一步增强联合用他汀降低血脂药物开发提供理论依据。

盐酸苄丝肼为白色或类白色结晶粉末，易溶于水，微溶于乙醇，其性质极不稳定，对溶剂、PH、光线、温度以及湿度的变化极为敏感。盐酸苄丝肼是一种外周脱羧酶抑制剂，常与左旋多巴联合制成复合制剂多巴丝肼用于帕金森病的治疗。但是目前还没有关于盐酸苄丝肼可以制备PCSK9抑制剂的报道。

发明内容

本发明的目的是提供盐酸苄丝肼在制备PCSK9抑制剂中的应用。

本发明通过HepG2细胞模型研究了盐酸苄丝肼对于PCSK9的抑制作用，结果显示盐酸苄丝肼对于LDL孵育的HepG2细胞模型的PCSK9表达具有显著的抑制作用，并且能够显著提升了LDLR的表达。具体是通过LDL孵育HepG2细胞构建高脂血模型，给予不同浓度的盐酸苄丝肼，结果发现盐酸苄丝肼能够显著降低HepG2细胞PCSK9的基因和蛋白水平表达，同时显著提升了LDLR的基因和蛋白水平的表达。将盐酸苄丝肼通过添加药学上可接受的载体制备成临床需要的各种制剂，其有益效果是：为制备PCSK9抑制剂提供新的途径。

附图说明

图1为HepG2细胞各实验组PCSK9 western blting蛋白条带结果图。

图2为HepG2细胞各实验组PCSK9 western blting数据统计分析结果图。

图3为HepG2细胞各实验组PCSK9 QPCR结果图。

图4为HepG2细胞各实验组LDLR western blting蛋白条带结果图。

图5为HepG2细胞各实验组LDLR western blting数据统计分析结果图。

图6为HepG2细胞各实验组LDLR QPCR结果图。

图7为盐酸苄丝肼对HepG2细胞毒性实验结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例

建立HepG2细胞高脂血症模型并给药

HepG2细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养。1-2d换液，待细胞长满后，0.25％胰酶消化，1∶3传代。将细胞分为control组、LDL组、BH-10^-8组、BH-10^-9组、BH-10^-10组。

将细胞以5×10⁶个/孔铺在六孔板内，24h后，除空白组外其余各组给予100μg/mL LDL孵育24h。之后BH-10^-8组、BH-10^-9组和BH-10^-10组分别给予10^-8、10^-9、10^-10M盐酸苄丝肼孵育24h。

提取细胞蛋白并做western bloting实验

收集细胞，冰0.01M PBS清洗细胞两次。每管细胞150μL RIPA细胞裂解液，使裂解液和细胞充分接触，置于冰上裂解30min。4℃ 12000rpm离心10min，取上清液，即为提取的总蛋白。利用BCA试剂盒检测各组蛋白浓度。