[发明专利]一种基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒

权利要求书

1.一种基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒，其特征在于，该试剂盒的内容物组成如下：96孔ELISA酶标板、包被抗体4F10、人PGRN标准蛋白、生物素标记的检测抗体5B7-biotin、Avidin与HRP的交联蛋白、包被缓冲液、封闭液、样品及检测抗体稀释液、ELISA酶标板洗涤液、底物液和终止液；

所述包被抗体4F10是针对人PGRN中GrnA结构域的小鼠抗人单克隆抗体，工作浓度为10μg/mL；

所述生物素标记的检测抗体5B7-biotin是针对人PGRN中GrnB结构域的小鼠抗人单克隆抗体，工作稀释比例为1：4000；

所述的包被缓冲液为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH为9.6；

所述封闭液为含体积分数为10％小牛血清的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；

所述样品及检测抗体稀释液为含体积分数为1％小牛血清的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；

所述ELISA酶标板洗涤液为含体积分数为0.1％Tween-20的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；

所述底物液为TMB；

所述终止液为摩尔浓度为2M的浓硫酸溶液；

所述人PGRN标准蛋白通过真核蛋白纯化的方法获得；所述Avidin与HRP的交联蛋白是采用过碘酸钠法将纯化的Avidin与HRP蛋白交联；

所述的过碘酸钠法是将HRP与过碘酸钠(NaIO4)反应，获得活化的HRP；

所述的Avidin与活化的HRP反应，获得Avidin与HRP的交联蛋白。

2.权利要求1所述的基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒用于制备乳腺癌、肺癌及Ⅱ型糖尿病病人的血清学检测试剂盒的应用；所述乳腺癌，肺癌及Ⅱ型糖尿病病人的血清学检测是检测重组的PGRN蛋白以及天然的人PGRN蛋白；

检测重组的PGRN蛋白以及天然的人PGRN蛋白具体包括以下步骤：

(1)包被ELISA酶标板：用包被缓冲液将包被抗体4F10稀释成10μg/mL，100μL/孔，4℃过夜；

(2)封闭：甩去孔中液体，加入200μL/孔的ELISA酶标板洗涤液，洗涤3-5次后，加入200μL/孔的封闭液，37℃、2h后，洗涤3-5次，并甩干；

(3)加待检测样品：向所述酶标板中加入待检测样品，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤3-5次，并甩干；

(4)加检测抗体：向所述酶标板中加入5B7-biotin，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤3-5次，并甩干；

(5)加Avidin与HRP的交联蛋白：向所述酶标板中加入Avidin与HRP的交联蛋白，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤5-6次，并甩干；

(6)显色：向所述酶标板中加入底物液，100μL/孔，37℃、3-5min后加终止液；

(7)终止：向所述酶标板中加入终止液，50μL/孔，反应后，酶标仪450nm处读数。