[发明专利]基于内吗啡肽-1和神经降压素(8-13)的嵌合肽及其合成方法和应用

权利要求书

1.基于内吗啡肽-1和神经降压素(8-13)的嵌合肽，其特征在于该嵌合肽的氨基酸序列如下：

Tyr-Pro-Trp-Phe-Gly-Gly-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu。

2.如权利要求1所述的基于内吗啡肽-1和神经降压素(8-13)的嵌合肽的合成方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理：检查固相合成仪的气密性，将带有一个氨基酸残基的Fmoc-Leu-Wang树脂放入合成仪，加二氯甲烷搅拌30～40min，使树脂充分浸泡溶胀后，减压抽滤溶剂；其中带有一个氨基酸残基的Fmoc-Leu-Wang树脂的质量与二氯甲烷的体积比为1g：(7～12)mL；

二、脱除“Fmoc”保护基团：将抽干后的溶胀树脂用DMF洗涤3～5min，抽干，重复3～5次，然后在树脂中加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5～10min后抽干，重复2～3次，再加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15～20min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂，最后用DMF洗涤除净脱保护溶液，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂；其中树脂的质量与第一次加入的脱保护溶液的体积比为1g：(8～12)mL；树脂的质量与第二次加入的脱保护溶液的体积比为1g：(10～14)mL；

三、氨基酸缩合反应：依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于DMF中，再加入二异丙基乙胺后混匀得混合溶液，然后将混合溶液加入到步骤二脱除“Fmoc”保护基团的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60～72min；

通过茚检试剂检测缩合反应完成的程度，反应完全后用DMF重复洗涤以除去未反应的残留液体；

四、肽链的延长：重复步骤二和三，按照嵌合肽氨基酸序列的顺序，从多肽的C-端到N-端依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸逐个缩合到树脂上，直至所有氨基酸残基缩合完成，得到肽树脂；

五、肽链从树脂上的切割：将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除，然后用二氯甲烷和甲醇交替洗涤肽树脂，充分抽干溶剂后，向肽树脂中加入切割试剂，于室温下切割反应3～5h；

收集切割试剂并减压旋干，用冰冷乙醚析出沉淀，静置后去除乙醚上清，再用水及乙酸充分溶解沉淀，倒入分液漏斗，并加入乙酸乙酯萃取，收集水相，经冷冻干燥，得白色的固体粉末粗肽；

六、粗肽的脱盐与纯化：以体积浓度10％-20％的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的多肽化合物，再通过反相高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的固体粉末纯肽。

3.根据权利要求2所述的基于内吗啡肽-1和神经降压素(8-13)的嵌合肽的合成方法，其特征在于步骤三中“Fmoc”基团保护的氨基酸的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的2.5-3倍。

4.根据权利要求2或3所述的基于内吗啡肽-1和神经降压素(8-13)的嵌合肽的合成方法，其特征在于步骤三中N-羟基苯并三氮唑的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的2.5-3倍。

5.根据权利要求4所述的基于内吗啡肽-1和神经降压素(8-13)的嵌合肽的合成方法，其特征在于步骤三中O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的2.5-3倍。

6.根据权利要求5所述的基于内吗啡肽-1和神经降压素(8-13)的嵌合肽的合成方法，其特征在于步骤三中二异丙基乙胺的摩尔量为Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔量的5-6倍。

7.根据权利要求6所述的基于内吗啡肽-1和神经降压素(8-13)的嵌合肽的合成方法，其特征在于步骤五中每克肽树脂加入10-25mL的切割试剂。