[发明专利]诱导型酵母转化重组系统的构建及其应用

说明书

本发明公开了一种诱导型酵母转化重组系统的构建及其在大片段DNA捕捉中的应用。所述的iTAR载体含有P_Gal1‑V10、I‑SceI、Ble^R、CEN6、ARSH4、URA3、同源臂1、同源臂2及同源臂间的I‑SceI酶切位点。iTAR载体可以通过半乳糖诱导Gal1‑V10启动子，产生I‑SceI酶，作用于I‑SceI酶切位点，使iTAR载体自身线性化，将大片段DNA转化到含iTAR载体的酿酒酵母中，实现空载体的降解和酵母体内的同源重组，达到克隆大片段DNA的目的。本发明的iTAR克隆方法简单、高效，能够快速、准确地从基因组中获得所需要的大片段DNA而无酶切位点的限制，转化效率可达73％左右。

技术领域

本发明涉及诱导型酵母转化重组系统的构建方法及其在捕捉线性大片段DNA中的应用，即利用iTAR克隆技术捕捉线性大片段DNA，具体涉及一种将具有同源序列的线性大片段DNA转入含有iTAR载体的酿酒酵母中，完成DNA的组装，属于生物技术领域。

背景技术

微生物能够产生许多具有生物活性的次级代谢产物，其中包括抗生素(Polymyxin)、抗癌药物(埃博霉素)、杀虫剂(阿维菌素)和免疫抑制剂(雷帕霉素)。合成这些次级代谢产物的基因簇一般都大于10kb，有的甚至超过100kb。然而传统的PCR克隆方法已不再能满足人们的需求，因此，迫切需要开发一种能高效捕捉大基因簇片段的方法。

目前，捕捉大基因簇的方法主要有基因组文库和同源重组策略，基因组文库主要包括Cosmid文库(Eiglmeier K,et al.Use of an ordered cosmid library to deducethe genomic organization of Mycobacterium leprae[J].Molecular microbiology,1993,7(2):197-206)，BAC文库(Choi S,et al.Construction and characterization ofa bacterial artificial chromosome library ofArabidopsis thaliana[J].PlantMolecular Biology Reporter,1995,13(2):124-128.)和YAC文库(Anand R,etal.A3.5genome equivalent multi access YAC library:construction,characterisation,screening and storage[J].Nucleic acids research,1990,18(8):1951-1956).，同源重组主要有RecE重组克隆(Gillen J R,et al.Genetic analysis ofthe RecE pathway of genetic recombination in Escherichia coli K-12[J].Journalof bacteriology,1981,145(1):521-532.)和TAR(Transformation-AssociatedRecombination)克隆(Li Y,et al.Directed natural product biosynthesis genecluster capture and expression in the model bacterium Bacillus subtilis[J].Scientific reports,2015,5.)。基因组文库因其具备容量大和易操作等优点，大片段基因组文库被广泛应用于动物、植物和微生物的基因组研究中，然而基因文库的随机性和筛选困难等缺陷限制了其应用范围。RecE重组克隆是利用噬菌体RecE将两条含有同源末端的线性DNA重组成环状质粒，由于该系统需要目的基因簇两端含有特异的酶切位点，因而限制了其使用。TAR克隆是基于转化介导的同源重组，没有酶切位点的限制，可以方便有效地对复杂、较大的DNA片段进行克隆。但传统的TAR克隆方法是将线性化的载体和线性化的大片段DNA同时转入酿酒酵母，然后利用酿酒酵母自身的同源重组机制，将大片段DNA克隆下来。由于两个DNA片段的共转化和酿酒酵母自身的修复机制，导致TAR克隆的效率仅为2％，因此，TAR克隆的应用也受到了一定的限制。