[发明专利]一种基于DNA微条形码技术的食用海参物种鉴定方法

说明书

本发明涉及一种基于DNA微条形码的食用海参物种鉴定方法。该方法通过海参基因组DNA提取，然后利用DNA微条形码引物进行PCR扩增，得到长度为257 bp的PCR产物，所述DNA微条形码引物为MiniCOI‑F:CATGGCTTTCCCTCGAATGAA；MiniCOI‑R:TAACTCCTGGGGTTCGCATCT。最后将测序所得的DNA微条形码片段序列在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）进行比对，根据序列的匹配相似度进行物种鉴别。该方法操作简便，准确性高，能够鉴别经过加工的、形态学特征消失的市售海参，为维护企业与消费者利益以及正常的市场秩序提供技术支撑。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体而言，本发明涉及一种基于DNA微条形码技术的食用海参物种鉴定方法。

背景技术

海参(sea cucumber)隶属棘皮动物门(Echinodermata)海参纲(Holothrioider)，共分为3亚纲、6目和25科。目前全球已知的海参共有1500 多种，其中具有较高经济和食用价值的海参约有60种。作为海参最大的消费市场，我国目前可供食用的海参共有20余种。海参在我国被认为是一种高蛋白、低脂肪的名贵海产品。其营养价值高且味道鲜美，富含蛋白质、氨基酸、多种维生素、必需脂肪酸以及微量元素等50多种营养成分，同时含有多糖、皂苷、胶原蛋白等重要的生物活性物质，在抗癌、抗肿瘤、免疫调节及抗凝血等方面可发挥显著功效。

在贸易中海参多以干海参、水发海参、精深加工的海参制品等形式流通，鲜活海参和冻品仅占一小部分。在加工过程中海参经过干制、切片、制粉等加工工艺，形态学特征基本消失，使得其种类和品质难以被消费者、经销商和监管部门鉴别。加之市场上海参种类繁多、产地不同、营养成分及其含量各异等因素导致海参的价格相差可高达10倍以上。受经济利益驱动，在贸易中海参掺假造假现象时有发生，例如海参产地的造假以及一些不规范厂家通过贴假标签用低值海参冒充高值海参等。

DNA条形码(DNA Barcoding)技术是利用一段标准的、较短的DNA序列作为分子标记，通过对生物体中一个或多个基因进行扫描，从而实现物种鉴定的技术。目前DNA条形码技术已经广泛应用于生物的分类和鉴定，是一种简便、高效、准确的物种鉴定技术。线粒体细胞色素c氧化酶亚基I(cytochrome oxidase subunit I，COI)基因是动物界中是最常用的DNA条形码。但是在一些加工食品中，由于其DNA遭到破坏，导致无法提取到完整的COI基因，此时提取到部分 COI基因(100bp-300bp)也可以准确鉴定物种。

本发明提供一种基于DNA微条形码技术的食用海参物种鉴定方法，有利于实现不同市售海参的准确鉴别。该方法与传统的形态学鉴定方法相比，可以解决形态学鉴定中因样品残缺不全无法准确鉴定的问题，而且鉴定准确性大大提高。此外，该方法可以为解决加工海参制品中的海参物种成分鉴定提供简单有效的科学手段。

发明内容

本发明的目的是建立一种基于DNA微条形码技术的食用海参物种鉴定方法，为海参市场的监管提供技术支持。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现:

一种基于DNA微条形码技术的食用海参物种鉴定方法，从NCBI网站上下载不同种类的食用海参的COI基因序列，利用MEGA6.0软件对序列进行多重比对，移除相同序列，找到保守区域。根据保守区域，利用primmer5.0软件设计DNA 微条形码引物，然后利用此引物对已知物种信息的海参的COI基因目的片段进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳确定PCR扩增结果，随后进行Sanger测序。将得到的基因序列利用DNASART软件中的SeqMan功能进行序列拼接，并删除拼接好的序列两端的引物序列。所得序列在NCBI网站上进行BLAST比对，根据相似度、覆盖度以及综合得分确定海参物种信息。将DNA微条形码鉴定结果与已知物种信息比较，评估DNA微条形码技术在海参物种鉴定中的有效性。