[发明专利]基于阳离子脂质体‑基因结合动力学的检测方法

说明书

本申请为申请号为2017108533953、申请日为2017年9月20日、发明名称为“基于阳离子脂质体-基因结合动力学的检测方法”的分案申请。

技术领域

本发明涉及阳离子脂质体非病毒基因载体领域，具体涉及基于阳离子脂质体-基因结合动力学的检测方法。

背景技术

近几十年来，随着对基因的深入研究，科学家发现许多疾病，如遗传性疾病癌症，都与人体的基因异常有密切关系。将正常的外源基因导入靶细胞，以纠正或补偿基因缺陷和异常，从根本上消除产生疾病症状的内因，达到治疗或者预防疾病的目的^[1]，从而产生了一种革新性的治疗方法，即基因治疗。基因治疗过程中，如何将基因安全高效地递送到病变组织或细胞，是基因治疗成功的关键。阳离子脂质体是目前研究最深入、应用最广泛的一种基因递送载体，可通过带正电的头部和基因上带负电的磷酸基团结合，有效地压缩基因形成复合物，使基因能够顺利通过各种障碍，如逃逸免疫系统、穿透细胞膜、从内涵体释放等，完成基因递送过程^[2]。在阳离子脂质体递送基因的过程中，阳离子脂质体与基因的结合动力学是阳离子脂质体介导基因高效递送的关键问题，阳离子脂质体与基因结合得太疏松，基因可能会在血液中提前释放而无法到达靶部位；两者结合得过于紧密又不利于基因与阳离子脂质体发生解离，影响基因在细胞内释放，从而影响其递送效率。

对于阳离子脂质体与基因结合动力学的研究，国内外相关报道甚少。Lai等^[3]跟踪了阳离子脂质体与质粒DNA在不同电荷比例下的复合过程，发现初始复合物很快形成，但随即聚集形成尺寸更大的复合物，大尺寸的复合物会影响载体的递送效率。梁德海课题组发现siRNA与聚酰胺-胺型树枝状大分子、商用试剂Lipofectamine 2000以及寡聚精氨酸形成的复合物随着时间也会发生再聚集^[4]，影响载体的转染效率。这些技术只是从阳离子脂质体与基因结合过程中复合物尺寸的变化，颗粒的聚集情况考察阳离子脂质体与DNA结合过程对转染效率的影响。国内外尚缺少通过动力学技术对阳离子脂质体与基因结合过程的研究，严重制约阳离子脂质体的发展。

凝胶电泳作为一种高分辨、高灵敏、高速度、高通量及低样品消耗的微分离技术，在生物分析领域具有广阔的应用前景。目前，对于凝胶电泳在动力学方面的应用还未有报道。

FRET是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团(供体)的发射光谱与另一个基团(受体)的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时(一般小于10nm)，就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。目前，对于荧光光谱法在阳离子脂质体与基因结合动力学方面的研究还未见报道。

发明内容

为弥补现有技术的不足，本发明提供了一种从宏观和微观检测阳离子脂质体-基因结合动力学的方法，通过琼脂糖凝胶电泳技术直观且定量的分析不同时间阳离子脂质体与基因结合情况。通过构建荧光共振能量转移体系，采用荧光光谱仪和停流光谱仪检测宏观及微观时间内阳离子脂质体与基因之间的结合动力学，并拟合其结合动力学方程。

本发明采用如下技术方案：一种阳离子脂质体-基因结合动力学的检测方法，具体步骤如下：

(1)制备阳离子脂质体/基因复合物，阳离子脂质体与基因的质量比(N/P)8：1～1：1，随即将上述复合物在0～70min进行琼脂糖凝胶电泳实验，通过琼脂糖凝胶电泳成像系统软件定量分析阳离子脂质体结合基因的量；

(2)采用荧光染料分别标记阳离子脂质体与基因，按阳离子脂质体与基因的质量比8：1～1：1制备阳离子脂质体/基因复合物，构建荧光共振能量转移体系，采用荧光光谱仪检测阳离子脂质体与基因结合0～70min内复合物的发光强度；

(3)将核酸染料与基因结合，构建FRET体系，加入阳离子脂质体使其与核酸染料竞争结合基因，采用停流光谱仪检测阳离子脂质体与基因在0-200s内的瞬时结合动力学，得到结合动力学曲线，通过停流光谱仪分析软件进行线性拟合，得到结合动力学轨迹符合线性方程y＝-0.0004x+1.3657。其中，x代表结合时间，y代表结合后荧光变化，用电压表示。

优选的，所述的阳离子脂质体为氨基酸型阳离子脂质体、肽型阳离子脂质体、单价季铵盐阳离子脂质体和双子型季铵盐阳离子脂质体。

优选的，所述的基因包括质粒DNA、siRNA。