[发明专利]一种核糖核酸酶抑制剂包涵体的复性方法

说明书

本发明涉及一种核糖核酸酶抑制剂(RI)包涵体的复性方法。本发明的方法在复性过程中应用了RNase A，使RI的复性得率大大提高，而RNase A很容易在后续的纯化过程中，经由一定浓度无机盐在偏酸性的条件下除去，而RI则可以藉由适当的纯化标签而结合于纯化柱上，从而很方便地进行纯化，得到高纯度的RI。

技术领域

本发明属于化学及生物工程领域；更具体地，本发明涉及一种核糖核酸酶抑制剂包涵体的复性方法。

背景技术

核糖核酸酶抑制因子(Ribonuclease Inhibitor，RI)是哺乳动物细胞浆中的一种酸性蛋白质，分子量50kD。它能够以1：1的比例结合并抑制胰腺核糖核酸酶超家族中的RNase A和血管形成因子(Angiogenin，Ang)。RI与Ang的结合引起人们的关注是因为Ang具有促进新生血管内皮生长的活性，而新生血管形成是实体肿瘤组织生长所必需的。将RI注射到小鼠的移植肿瘤组织内，导致实体肿瘤组织大面积坏死及新生血管明显减少。根据RI一级结构的一个重要特点，32个半胱氨酸残基全部为还原状态，认为RI具有抗氧化的作用。这一作用在细胞水平得到证实：能够过表达RI的C6细胞抗过氧化氢损伤的能力明显增强。因此，通过基因工程的方法生产具有生物活性的RI无疑具有重要作用。

RI是一种多功能的体内重要的调节分子，是核糖核酸酶A(RNase A)的抑制剂，它与RNase A紧密结合，形成马蹄形的立体结构，从而导致核糖核酸酶的活性受到抑制。它参与基因的表达与调控，是具有重要功能的一种蛋白质。在RI的结构中，有11对二硫键和8个游离的巯基。巯基是RI的活性必需基团，巯基的氧化会导致RI的失活。作为RNase A的抑制剂，RI在体外实验中可以保护mRNA及rRNA免受RNase的降解，导致蛋白质合成旺盛。在生长旺盛的组织如再生肝和妊娠鼠肝中皆可检测到RI活力增强。在衰老过程中，人体RI活力下降，RNase A活力上升，RNA降解加快，蛋白合成速度下降。即当内外环境改变时，易使含有30个-SH的RI的活性下降甚至失活，导致体内主要以RNase A-RI，复合物形式而存在的RNaseA呈游离状态，加速RNA(特别是mRNA，及rRNA)降解，进而影响蛋白质的合成速率，引起组织萎缩、功能下降。RI及RNase A的活性与机体的状态及年龄有关，故可作为研究衰老的指标之一。总之，RI通过对RNA和蛋白质的调节作用而对组织细胞的功能状态起调节作用。

核糖核酸酶抑制剂(RI)的制备方法主要是直接从人体胎盘提取、大肠杆菌重组可溶性表达、包涵体复性这三种方法获得。

直接从人体胎盘提取核糖核酸酶抑制剂(RI)的方法是由美国Promega公司最早发现并建立的，但是采用该方法所使用的原料人体胎盘近来受到国家的管控，而且人体胎盘也会存在母体病毒污染的风险，提取收率偏低，再加上存放的时间、温度都会对核糖核酸酶抑制剂(RI)产生不确定的影响，无法实现大规模的生产。

因此，当前多采用基因工程的方法，使用大肠杆菌系统进行制备。大肠杆菌表达系统具有技术成熟、目的蛋白表达量高、操作简单等特点。通过克隆人体胎盘的核糖核酸酶抑制剂的基因序列，构建表达载体，在大肠杆菌中进行表达，成为一种全新获得核糖核酸酶抑制剂(RI)的方式。但是核糖核酸酶抑制剂(RI)序列中含有11对二硫键和8个游离的巯基，在进行大肠杆菌诱导表达过程中蛋白结构易于错误折叠，表达产物主要以包涵体的形式存在。

中国专利申请CN102234649A报道可以进行RI的可溶性表达，但是需要在RI序列5’-端加入TrxA硫氧还蛋白融合标签，纯化过程中采用TEV酶切的方式再将标签去除，该方法存在着TrxA标签切除不彻底、TEV酶残留污染等问题。

中国专利申请CN1584031A报道人来源的核糖核酸酶抑制剂(RI)可以经原核系统(大肠杆菌)、真核系统(酵母)进行表达，然后菌体破碎、亲和层析纯化，但并未公开提及其表达的可溶性程度。