[发明专利]一种可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片及其制备方法和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及集成微流控芯片制造技术和基因诊断领域，尤其涉及一种可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片及其制备方法，以及一种采用微流控芯片进行病原体核酸的检测方法。

背景技术

人类健康和医学的发展史是一部与各种感染性疾病斗争的历史。每一次新发感染性疾病的出现，都导致了严重的社会恐慌和经济损失。呼吸道感染作为儿科的常见病、多发病，是引起世界范围内5岁以下儿童死亡的首位原因，其临床表现易被认识，但引起呼吸道感染的病因却很难明确。

呼吸道病原体的实验室检测，可以明确感染病因，有利于对疾病做出及时诊断、治疗，制定防控策略，阻止传播和流行。下呼吸道感染是最常见呼吸道感染性疾病，其中以社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)为多见，是威胁人群健康的常见感染性疾病之一。我国每年有数百万人罹患CAP，近年来，由于社会人口的老龄化、免疫损害宿主增加、病原体变迁和抗生素耐药率上升等原因，CAP的诊治面临许多新问题。CAP是在院外由细菌，病毒、衣原体和支原体等多种微生物所引起。肺炎链球菌和肺炎支原体在CAP的感染率分别为27％，15％。因此，检测上述高感染率的呼吸道病原体，有助于对CAP做出及时诊断、治疗，制定防控策略，阻止传播和流行。自1850年首次使用海藻(琼脂)生产培养基方法到分子生物学方法被引入病原体检测，微生物学检测法的变化日新月异。目前实验室检测方法主要包括病原体分离培养、血清学检测和分子生物学检测。肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia，Sp)和肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia，Mp)分离培养虽然高度特异，但其敏感性较低，周期较长。病原体血清学抗体检测不能解决免疫学检测的“窗口期”问题，无法判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。病原体血清抗原检测虽具有很高的检测价值，但检出限为10^5-7个病原体，灵敏度低，限制了其在临床实验室的广泛开展。基于病原体DNA或RNA的核酸检测方法具有高敏感性、高特异性等优点，聚合酶链反应(PCR)技术已在实验室诊断中起到了关键的作用，已成为目前所有病原体首推的重要的确诊手段之一，但是，由于用于临床实验室的PCR技术都需依赖特定场所、设备、仪器及经培训上岗的工作人员，操作复杂，费时，技术要求高不适合病原体检测的常规开展。因此，临床微生物实验室急待研发、转化和推广快速、灵敏和准确的鉴定上述病原体核酸的技术方法。目前，FilmArray呼吸道病原体检测仪作为一种容易操作的多重PCR平台，可用于多重病原体检测，但仍需精良仪器对操作过程进行控制，且检测费用昂贵，限制了其在临床上的广泛使用。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新型的体外等温扩增特异性核酸片段技术。此技术主要利用两对特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，从而保证引物可以在等温条件下顺利与模板结合并进行链置换扩增反应。因为其克服了传统PCR反应需通过反复的热变性过程获得单链模板的缺点，并避免了反复降温的耗时过程，实现了恒温条件下的连续快速扩增，可以在15-60分钟扩增出10⁹-10¹⁰倍靶序列拷贝，具有更高的灵敏度、特异性和扩增效率。LAMP在病原微生物的快速检测、遗传病诊断、单核苷酸多态性分型等领域显示出巨大的应用潜力。目前LAMP已应用于肿瘤突变基因、结核分枝杆菌、及病毒的快速检测。