[发明专利]一种深渊海参来源的超氧化物歧化酶Cu,Zn SOD的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种深渊海参来源的超氧化物歧化酶Cu,Zn SOD的制备方法及其应用，该方法通过提取Paelopatides sp.的总RNA，经RT‑PCR反转录为cDNA，通过PCR扩增获得了编码超氧化物歧化酶的基因序列PaSOD，在pColdⅡ载体中构建原核表达重组质粒，导入大肠杆菌Chaperone Competent Cell pG‑KJE8/BL21中进行重组蛋白可溶性表达，通过该方法制备的重组蛋白克服了原料来源难以获取、蛋白变复性回收过程复杂繁琐等不足，纯化后的蛋白纯度高、活力好，温度适应范围广，能够抵御高浓度的消化酶消化，为该蛋白广泛应用于生物、食品、医药、美容等领域奠定基础。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种深渊海参来源的超氧化物歧化酶Cu,Zn SOD的制备方法及其应用。

背景技术

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)简称SOD，是一种广泛存在于自然界的生物酶，按所含金属种类不同可分为铜锌SOD、锰SOD、铁SOD以及镍SOD等几种。现在市场上出售的SOD大多都从血液中提取，属铜锌SOD(Cu,Zn-SOD)。Cu,Zn-SOD分子由两个亚基组成，每个亚基含有一个铜离子和一个锌离子，分子量在32000Da左右。SOD是一种生物酶，其化学本质是蛋白质，国内外对其毒性进行了广泛的研究。实验表明，它对人体无毒副作用，是一种纯天然的生物活性物质。

Cu,Zn-SOD是一种特殊的生物酶，因此具有许多特殊的功能，当前地球生存环境日益恶化，诱发产生大量自由基，对人体健康产生影响。研究表明，通过适量补充摄入SOD，人体可能通过一些特殊的消化吸收机制，使得一定量SOD进入人体发挥功能，从而有效保护人体细胞不受到过量氧自由基的破坏，延缓细胞的衰老过程，延长寿命(Cicek E,Yildiz M,Delibas N,et al.The effects of 201Tl myocardial perfusion scintigraphystudies on oxidative damage in patients[J].West Indian Medical Journal,2009,58(1):50.)。此外，国内外SOD的应用还集中在作为药用酶原料、化妆品的添加剂、功能食品的强化剂等几个方面。目前SOD应用技术的主要瓶颈仍然是传统的动植物提取出来的SOD存在稳定性较差，活性难以保持等。因此，开发高效优质SOD基因，利用基因工程菌发酵生产提取SOD势在必行。深渊生物生存环境恶劣，由于受到采样技术和样品保存的限制，目前对其功能基因的开发存在国内外研究匮乏的现象。对其SOD的报道也相对较少，尤其是Cu，Zn-SOD。另外，目前通常使用的蛋白表达制备方法多以包涵体的方式进行，表达的蛋白常常没有活性，不可回收或者要进行变复性回收。存在成功率低，操作繁琐，耗时长，酶活损失大等缺点。

发明内容

有鉴于此，本发明针对目前SOD稳定性较差，活性难以保持，优质SOD基因难以获取、蛋白变复性回收过程复杂繁琐等不足的问题，提供了一种深渊海参来源的超氧化物歧化酶Cu,Zn-SOD及其制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种深渊海参Paelopatides sp.来源的超氧化物歧化酶的编码蛋白，其具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相似或同等功能的氨基酸序列。

本发明还公开了一种编码上述蛋白的基因。

进一步地，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明还公开了一种含有上述基因的pColdⅡ载体。

本发明还公开了一种含有上述载体的Chaperone Competent Cell pG-KJE8/BL21表达宿主细胞。

本发明还公开了一种深渊海参来源的超氧化物歧化酶Cu,Zn-SOD的制备方法，具体按照以下步骤实施：