[发明专利]一种提高重组人凝血因子VIII高效表达的方法

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体是一种提高重组人凝血因子VIII(Recombinant Human Coagulation Factor VIII，简称“rhFVIII”)高效表达的方法，尤其涉及一种在哺乳动物细胞中提高基因重组人凝血因子VIII表达量的方法。本发明通过重组人凝血因子VIII基因序列的选择与设计、重组表达质粒和工程细胞的构建与筛选以及利用一定浓度的血清培养基培养阳性细胞，使重组人凝血因子VIII高效表达。该方法克服了现有细胞株构建困难、生产复杂、表达量较低等缺点，在降低研发成本的同时还具有快速、简便、稳定等特点，为重组人凝血因子VIII的工业化转移提供了简便方法，对于生物制品的开发以及治疗研究具有重要的研究与应用价值。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体是一种提高重组人凝血因子VIII(Recombinant Human Coagulation Factor VIII，简称“rhFVIII”)高效表达的方法，尤其涉及一种在哺乳动物细胞中提高重组人凝血因子VIII 表达量的方法。

背景技术

A型血友病是一种常见的X性连锁遗传性出血病，在所有血友病中占85％，发病原因于1950年代被发现，1960年代开始血液提取进行治疗，1970年代实现患者在家自我注射治疗，1980年代爆发了患者感染肝炎病毒和HIV病毒事件，1990年代开始采用重组人凝血因子治疗，从2000年代开始对重度血友病患者推荐日常预防性治疗。血友病的平均发病率约为5-10/10万，因此估计全球约有40万患者，中国约有10 万。2014年，血友病联盟(WorldFederation of Hemophilia,WFH)对登记在册的血友病人数调查显示，全球约为17.85万人，而中国仅有11108人登记在册。中国每万人口的血友病人数仅为0.08，而欧洲发达国家约为1，美国为0.54，印度为0.14，整体看来，中国的血友病诊断和治疗覆盖率还存在很大差距。

目前FDA已经批准了15个用于治疗A型血友病的重组人凝血因子VIII(Recombinant Human Coagulation Factor VIII)产品。其中Advate(百因止)、Kogenate(拜科奇)、Xyntha(任捷)已经进入中国。目前全球的因子VIII销售年达到了70亿国际单位，其中60％为基因工程重组凝血因子VIII。rhFVIII 具有与血源性F8相似的生物学效应，但产量不受血源供应的影响，且避免了HBV、HCV、HIV等血源性病毒感染的发生，rhFVIII在中国血友病A患者的使用中，具有较好的有效性及安全性。然而，批准进入中国的拜科奇与百因止价格昂贵，并且中国目前还不能生产重组人凝血因子，加上血友病A目前尚不能治愈，因此需要终生使用rhFVIII进行替代治疗。使得费用问题成为我国绝大多数A型血友病患者治疗的主要限制性因素，因此，自主研发生产rF8对于国内患者需求的满足有着积极的意义。

体外真核细胞表达的BDD-F8蛋白显示出较好的凝血生物活性，但缺点为容易降解。为了提高rhFVIII 的表达量并且降低蛋白的降解，科学家曾在哺乳动物细胞中共转染rhFVIII和VWF基因，稳定rhFVIII的表达，但这该方法存在一定的局限性。研究发现，VWF与rhFVIII共表达，造成外源DNA进入细胞过载，细胞株构建比较复杂，同时细胞共表达压力，导致rhFVIII的表达量比较低，筛选出的高表达vWF等稳定因子细胞株后续也难以满足产业化要求。另外，目前细胞表达培养中都使用无血清培养基，这是因为无血清可避免血清批次间的质量变动，避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染，避免血清组分对实验研究的影响和对产品纯化的影响。

发明内容

本发明为了解决上述问题，提高rhFVIII的表达量，通过重组人凝血因子VIII基因序列的选择与设计、重组表达质粒和工程细胞的构建与筛选以及提供了一种含血清的培养方法来实现rhFVIII的工业化生产，通过对血清含量进行了摸索，得到了最优的血清加入量，血清的加入量对分离纯化不产生影响，同时使 rhFVIII的表达更简单、高效。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：