[发明专利]一种玉米种子超低温保存的改进方法

说明书

在超低温下保存植物种子是能够实现种子长期保存的方法。本发明实现了在PEG4000和甘油，还有羟丙甲基纤维素，氯化钠进行简单处理后的种子，通过特殊的处理手法和步骤，可以高效的在超低温状态下进行植物种子的长期保存，并且通过本方法对比常规的超低温保存方法，能够在种子解冻后获得高活力，高出芽率的种子。

技术领域

本方法涉及到一种植物种子超低温保存的技术，通过改进的超低温保存方法和处理手段，能够最大限度的增大植物种子冷冻复苏后的存活力。

背景技术

种子的超低温保存，是指利用液氮等其它技术和冷源，使得种子在超低温下新陈代谢基本停止，遗传与裂变不发生的情况下的种子低温保存技术。在超低温下保存的生物资源相比于其它保存方法，不有强烈的组织破坏性，而且也不污染环境，免于病虫害的侵扰，具有保存物质的持久性，稳定性等一系列的优点。经过超低温下保存的种子资源，其化学成分不变，遗传组分也无任何改变，经过解冻后可以直接运用于下游的各种育种的分子生物学实验，非常的方便。但是利用超低温下保存玉米种子资源，也存在着种子资源超低温解冻后存活率低，发芽率低，出芽后适应期长，生长速度慢等一系列问题。

为了更好的进行玉米各品种的资源研究，以及启动进行玉米各品种资源鉴定和资源保护的研究。发展新的改进方法，寻找一种有效而且价廉的方法，在超低温下进行有效的玉米种子保存技术，解决种子超低温保存后的出芽复苏率低的问题已经迫在眉睫。

为此，我们实验室经过各种实验优化程序，找到了一种适宜玉米种子在超低温下保存的最佳和最便宜的途径。经过多次各种实验条件验证，有优良效果并且显著的提高了超低温解冻之后的种子的出芽率，存活率，以及种子出芽后的生长速度。

发明内容

目的是为了更好的保存植物的种子，解决在超低温保存植物种子的过程中，如何进一步增大种子复苏后活力，出芽率等等问题。

附图说明

经过我们的冻存步骤特殊处理的濮玉5号玉米种子，相比对于传统的冻存濮玉5号玉米种子的方法，具有明显更优良的适应环境的表现。在同样的复活步骤处理的过程中，经过特殊冻存步骤处理后的种子，发芽率高，其早期的生长也比传统处理方法生长更快，生长也更旺盛。保存种子出芽效果对比图，图1没有改进直接冻存后的种子出芽情况，图2改进后经过保护方法处理后的冻存种子出芽情况。种子出芽率和已发芽的种子一周的株高长度(单位cm，α＝0.01极为显著差异)

具体实施方式

对于传统的冻存方法，是将种子在低温下进行直接保存。本实验室发展出了一套精细的简单处理玉米种子冻存方法与流程，可以显著的增加冻存后复苏的效果。

配置聚乙二醇PEG4000和甘油混合的保存液若干量，至少需要能装下所需要的种子。两者的浓度比例为1∶1。经过多次试验，我们确定采用混合的保护液配方，更有利于超低温保护种子。另外，配制羟丙甲基纤维素氯化钠无菌水缓冲液，浓度为羟丙甲基纤维素0.5％，氯化钠为0.5M/L。将种子先至于无菌的聚乙二醇PEG和甘油混合的保存液中5分钟，然后再至于无菌的羟丙甲基纤维素氯化钠缓冲液中浸泡5分钟。

这个方法实施的具体过程是

1在控制温度为25度，湿度为60％的小房间中，准备一盆装有37度的预热的无菌水，在此温度下准备玉米种子若干。37度的预热的无菌水提前配制且预热，无菌的聚乙二醇PEG和甘油1∶1混合的保存液也要事先混合配制好，还有无菌的羟丙甲基纤维素氯化钠缓冲液0.5％(含氯化钠为0.5M/L)也都提前配制并且37度预热。

2准备一个空的灭菌超低温保存管，当然需要管的体积要足够大，足以装下玉米的种子

3选择饱满而且稍微红晕的玉米种子，在超净台中，将玉米种子用双氧水灭菌消毒，然后再用无菌水冲洗玉米种子3遍待用。