[发明专利]一种提高DNA高保真聚合酶PCR扩增效率与扩增长度的方法

说明书

本发明介绍了一种提高高保真DNA聚合酶PCR扩增效率的方法。该方法通过在PCR高保真酶反应体系中加入Triton X‑100，羟丙甲基纤维素和氯化镁缓冲液等方法来提高高保真DNA聚合酶的扩增效率。该方法提高了普通高保真DNA聚合酶的扩增长度，扩增速度，扩增效率，具有非常简便快速，有利使用的优点。

技术领域

本方法涉及到一种高保真DNA聚合酶的扩增即使，通过改进高保真DNA聚合酶的反应缓冲液和加样步骤，能够实现高保真DNA聚合酶最大的DNA扩增效率

背景技术

PCR是现代分子生物学技术非常常用的技术，由此由该技术也衍生出来了许多的技术方法和改进应用技术运用。PCR是一种利用聚合酶扩增的基因DNA片段的方法，在不断升温和退火降温的过程中，通过人工设计的靶向引物，可以在聚合酶的帮助下，结合靶标DNA而有靶向性的只扩增目的专有片段。利用该技术，可以大大的加速研究的靶向基因的浓度，方便下游的DNA片段的处理和操作。

在现代分子生物学基因扩增的过程中，我们经常会面对不得不扩增长片段的苦恼。这些长片段往往长于一十甚至二十kbp以上，而且这些序列的核酸往往富含高GC含量，序列的复杂度高。在提取DNA的过程中，如何模板不纯，我们也往往需要面对复杂模板的过程。在这样的模板中，甚至可能存在一些抑制DNA聚合酶功能的因素，导致扩增效率下降。

在目前，我们主要依靠经过改进的PCR聚合酶来进行DNA长片段的扩增，如果DNA片段过长，会极大的影响扩增的效率，扩增的过程容易中断，酶容易从模板上脱落下来。而如果一个PCR酶已经固定了，如何针对这个固定的酶优化反应条件，进一步提高其扩增能力，增加扩增长度，包括跨越超长的GC复杂模板区域也是一个问题。另外，在DNA扩增的过程中，对DNA扩增序列的保真性有时候要求很高。某些DNA聚合酶具有强大的3-5’校正功能，可以用于一些保真性非常高的实验需求。但同时拥有强大的校正功能的DNA聚合酶，由于在扩增的过程中需要不停的进行序列校正，却往往扩增得很慢，导致扩增效率不高。这种DNA高保真酶也对各种反应条件的兼容性普遍不高，对各种复杂序列的处理也乏力，其扩增长度也大减。所以，针对这类聚合酶的反应状况，如何提再高他们的扩增效率与扩增长度，也是值得我们进一步考虑的问题。

本实验室摸索了一套针对高保真DNA聚合酶的扩增条件，经过优化的实验条件和扩增条件，能够比较有效的扩增长片段和复杂GC含量的模板，对一些比较复杂的DNA样品，也有着较强的兼容能力。

发明内容

目的是为了解决利用高保真DNA聚合酶扩增的过程中，如何进一步增大高保真DNA聚合酶的活力，解决高保真DNA聚合酶扩增复杂模板和长片段所面临的问题。

附图说明

对比普通的PCR过程，我们扩增内参基因和长的高GC含量的靶基因片段NCBI参考序列号AF493800作为参照。内参基因的引物为：5’ccacctcttcgagcaggtgatt和5’ctacgatttgtttttggttttt。扩增程序为95度变性5min，循环阶段为95度变性30秒，55度退火30秒，72度延伸30秒，共35个循环，最后延伸72度10分钟，16度下停止。对于长片段高GC含量的靶标基因，我们扩增序列为AF493800，引物为5’AGAAAGCTCACTCCTCTTC和5’GCATTTTCTCTTGCCAAAGGCAG扩增条件为95度变性5分钟，循环阶段为95度变性45秒，60度退火45秒，72度延伸时间分别为120秒，扩增34个循环，最后延伸都是72度10分钟，16度停止反应。在1.2％的琼脂糖凝胶下EB染色检测结果如图。

我们发现经过改良的PCR缓冲液的配方和反应条件，能够极大的增加PCR的扩增效率，即使在高GC含量的模板，长PCR扩增产物的要求下，也能比原来方法达到更好的效果。图1高保真酶PCR内参基因电泳，图2高保真酶长靶标基因电泳。

具体实施方式

经过摸索的高保真DNA聚合酶的扩增条件：在扩增的体系中，以20ul的扩增体系为例，加入0.5ul的Triton X-100入PCR反应液中，另外加入微量的0.5ul的羟丙甲基纤维素氯化镁缓冲液。羟丙甲基纤维素氯化镁缓冲液的配方为1L的去离子水中，含有羟丙甲基纤维素15克，氯化镁10克。PCR实验前，先在冰上加入羟丙甲基纤维素氯化镁缓冲液和PCR的缓冲液预先混合，然后再与PCR的反应酶预先混合。最后PCR的时候，将缓冲液和DNA模板，引物等进行混合。其它的扩增条件，都根据模板来设置。其引物设计和高保真酶的反应条件的和正常的高保真DNA聚合酶的扩增条件一致。