[发明专利]一种枯草芽孢杆菌及其在海藻酸裂解酶生产中的应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌突变菌株及其在海藻酸裂解酶生产中的应用。所述突变菌株是通过紫外诱变方法筛选获得的，能显著提高海藻酸裂解酶的产量，摇瓶发酵酶活能达到1500U/ml，比出发菌株提高了30.4％；20L罐发酵酶活高达3600U/ml，比出发菌提高了32％。所述突变菌株将有利于降低海藻酸裂解酶的生产成本，市场前景广阔。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌突变菌株及其在海藻酸裂解酶生产中的应用。

背景技术

海藻酸是储量仅次于纤维素的海洋生物多糖。海藻酸存在于海藻的细胞壁和细胞间质中，在褐藻中的含量最为丰富，大多数巨型褐藻是海藻酸的潜在来源。但不同种类的褐藻，其所含海藻酸的性质不同，所以要根据褐藻的可用性及其海藻酸的性质来选择褐藻的来源。海藻酸主要的商业来源是泡叶藻、公牛藻、翅藻、海带、巨藻、马尾藻和喇叭藻，其中最重要的是海带、巨藻和泡叶藻。全球海藻酸的产地主要分布于沿海国家和地区，如挪威、美国、法国、中国、日本和韩国。

目前，海藻酸降解的方法可分为三大类：一类是化学降解法，目前广泛采用的是酸水解法，这种方法操作步骤繁琐，反应条件剧烈。此外，还有过氧化氢氧化降解法；第二类是物理降解法，例如超声降解海藻酸；第三类是海藻酸裂解酶酶解法，酶法降解海藻酸条件温和，过程可控，得率高，绿色安全，环境友好，作用机理明确，产物确定，可以根据具体目的产物要求选择单一或组合使用不同底物专一性的酶制剂。

海藻酸裂解酶通过β消去反应裂解海藻酸的4-O-糖基键，同时在C-4和C-5 之间形成双键，在产生的寡糖的非还原端产生4-deoxy-L-erythro-hex-4-ene pyranosyluronate在230-240mm有强吸收峰。按底物的特异性，海藻酸裂解酶分为三种：第一种是聚甘露糖醛酸裂解酶，对polyM有特异性；第二种是聚古罗糖醛酸裂解酶，对polyG有特异性；第三种是对polyMG有特异性的裂解酶。按作用方式又可分为内切海藻酸裂解酶和外切海藻酸裂解酶。

海藻酸裂解酶的来源广泛，主要有三大类，第一类是微生物，如海洋细菌、土壤细菌、真菌等；第二类是海洋软体动物和棘皮动物，如海螺、海参、鲍鱼等；第三类是植物，如巨藻、泡叶藻、海带等。

目前，海藻酸裂解酶的生产大多是依靠海藻酸分解菌。虽然野生型海藻酸分解菌能有效的获得定量的酶蛋白，但产量很低成本较高，难达到实际应用要求。因此，利用基因工程手段对海藻酸裂解酶基因进行异源表达是提高海藻酸裂解酶产量的最有效途径。研究主要集中在海藻酸分解菌的海藻酸裂解酶基因的克隆和在大肠杆菌中过表达。目前，已有二十多种海藻酸分解菌的海藻酸裂解酶基因被克隆，而且其中大部分基因已成功地进行了异源表达。重组海藻酸裂解酶的表达量均高于野生菌株。1993年，Maki等研究人员，在大肠杆菌中表达了 Pseudomonas sp.OS-AIG-9的海藻酸裂解酶，其重组酶活性是野生菌株的53倍。

目前开发海藻酸裂解酶高产菌株仍是本领域的研究热点，对于降低海藻酸裂解酶的生产成本具有重要的意义。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种高产海藻酸裂解酶的枯草芽孢杆菌。所述菌株是通过紫外诱变的方法筛选获得的突变菌株，其海藻酸裂解酶产量得到明显提高，有利于大幅降低该酶的生产成本，市场前景广阔。

为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

本发明一方面提供了一株突变菌枯草芽孢杆菌ALY-38(Bacillus subtilis ALY-38)，已于2017年12月4日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017758。

所述的枯草芽孢杆菌工程菌，其携带有表达海藻酸裂解酶基因的重组载体。

所述海藻酸裂解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码核苷酸序列为SEQ IDNO:2。