[发明专利]基于抗独特型纳米抗体的Cry1Ab毒素模拟抗原及其应用

说明书

本发明属于基因工程抗体和食品生物技术领域，涉及基于抗独特型纳米抗体的Cry1Ab毒素模拟抗原及其应用，该Cry1Ab毒素模拟抗原氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所述，本发明提供的Cry1Ab模拟抗原可以替代价格昂贵且具有毒性的Cry1Ab标准品，并作为竞争抗原应用于Cry1Ab的竞争免疫学检测，其具有与Cry1Ab分子相似的免疫反应特性，效果良好。

技术领域

本发明属于基因工程抗体和食品生物技术领域，具体涉及一种基于抗独特型纳米抗体的Cry1Ab毒素模拟抗原及其应用。

背景技术

Bt毒素是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在形成芽孢时产生的一种伴孢晶体蛋白，可分为晶体蛋白(crystal protein,Cry蛋白)和细胞外溶解性蛋白(cytolytic protein,Cyt蛋白)两大类，其对鳞翅目、鞘翅目等多种昆虫具有杀虫活性。其毒性作用机理是Bt原毒素在昆虫中肠碱性环境及蛋白酶的作用下，水解为60-70KD的激活毒素，然后与中肠上皮细胞膜上的特异受体结合，从而导致细胞膜穿孔，最终导致昆虫死亡。Bt毒素对目标昆虫具有高度特异性，对人类和动物无害，已经被广泛应用于棉花、玉米和水稻等农作物的害虫防治中。其中，Cry毒素为Bt毒素中应用较为广泛的一类毒素，而Cry1Ab毒素是转基因作物中最常见的Cry毒素之一。

随着转基因作物的大规模推广和应用，人们开始对转基因作物的安全性问题产生顾虑，许多国家已经对转基因产品实行标签制度。因此建立快速、有效的Bt毒素检测方法是摆在各国政府面前的一项亟待解决的主要任务。

目前，Bt毒素的检测方法主要包括PCR方法和ELISA方法。PCR方法具有高灵敏度和高准确性，但局限于Bt毒素基因水平的检测，且需要相对完备的实验室和专业的操作人员。ELISA方法针对于Bt毒素蛋白表达水平的检测，具有简便、低耗、高通量等优点，是应用最广的Bt毒素检测方法，尤其以双抗夹心ELISA最为常见。然而，双抗夹心ELISA方法的建立需要进行两种抗体的制备及配对，过程复杂，周期长，且ELISA反应步骤繁多。与之相比，竞争ELISA具有过程简单、操作简便的优点，但竞争ELISA的建立必不可免的需要一个合适的竞争抗原或抗原模拟物。

纳米抗体(Nanobody)来源于骆驼和羊驼体内，是目前已知最小的功能性抗体片段，只含有3个CDR，却具有与普通抗体相同的抗体功能。与普通抗体相比，纳米抗体的CDR3更长，可以形成凸环结构，能够伸入酶的凹槽、裂缝或抗体的凹穴等普通抗体难以达到的表位。此外，纳米抗体的FR2区中4个疏水残基突变为亲水残基，使纳米抗体的水溶性更好。分子内CDR1与CDR3能形成一对二硫键，使纳米抗体具有好的稳定性。因此，纳米抗体是一种天然的、理想的模拟抗原材料。

发明内容

针对目前转Bt Cry毒素农作物及其毒素制剂的广泛应用所产生的安全性隐患和监管需求，本发明筛选基于抗独特型纳米抗体的Bt Cry1Ab毒素模拟抗原，建立简便、快速的竞争免疫分析法并应用于实际样品的检测。

本发明首先提供了一种驼源的基于抗独特型纳米抗体的Cry1Ab毒素模拟抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所提及的Cry1Ab模拟抗原(纳米抗体)包括四个框架区FR和三个互补决定区CDR。其中，框架区(FR1-FR4)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.8所示；互补决定区(CDR1-CDR3)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQID NO.5和SEQ ID NO.7所示。

本发明同时提供了编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示Cry1Ab毒素模拟抗原的核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明还提供了含有序列如SEQ ID NO.9所示的核苷酸的重组表达载体及重组工程菌。