[发明专利]肝片吸虫多表位融合诊断抗原及其应用和制备方法

说明书

本发明公开了一种肝片吸虫多表位融合诊断抗原分子Fh‑meAg2的制备方法及其应用，属生物技术领域。本发明通过对Fh重要基因SAP2、Cathepsin L1D和Cathepsin B4和进行克隆，利用生物信息学软件对Fh重要基因编码蛋白的氨基酸序列进行分析，筛选优势抗原表位，并将采用柔性氨基酸将筛选得到的优势抗原表位按照一定的排列组合进行串联，构建并合成多表位融合抗原(Fh‑meAg)基因。将Fh‑meAg基因克隆入表达载体中，在大肠杆菌中进行表达，制备重组蛋白Fh‑meAg，通过血清学试验筛选获得了强反应原性的重组蛋白Fh‑meAg2。即210(3)。与现的技术相比，本发明的肝片吸虫重组多表位融合抗原Fh‑meAg2的具有高特异性和敏感性，是一种有应用价值的Fh感染诊断抗原分子。

技术领域

本发明涉及一种肝片吸虫多表位融合诊断抗原分子Fh-meAg2的制备方法及其应用，属生物技术领域。

背景技术

肝片吸虫病(Fascioliasis)是由肝片吸虫(F.hepatica，Fh)所引起的一种草食动物常发寄生虫疾病。成年动物感染多呈慢性发病，难以早期诊治，而幼年动物发病临床症状明显，严重可致死亡。

该寄生虫能对肝脏和肠道造成机械性损伤，引起器官组织创伤、出血，寄生于胆管中的虫卵和幼虫堵塞胆汁通道，引发肝炎、胆管炎、腹膜炎；肝片吸虫生长以红细胞为养料，可致红细胞减少和血管渗透性增强，导致机体贫血，严重影响了反刍动物养殖业的发展。同时，Fh还可以引起人感染，是一种对牧民危害较大的人兽共患寄生虫病。

肝片吸虫(F.hepatica，Fh)又称肝蛭或柳叶虫，属扁形动物门(Platyhelminthes)、吸虫纲腹殖目(Digenea)、片形科(Fasciolidae)片形属(Fasciola)，可导致草食动物发生慢性高危性寄生虫病。肝片吸虫的终末宿主是牛、羊、骆驼等动物，中间宿主是椎实螺。成虫在胆管内聚集，排出大量虫卵，虫卵随胆汁进入消化道，随粪便排出体外。虫卵在适当的温度、水分及光线的环境中形成毛蚴。毛蚴钻入椎实螺，在螺体内经过胞蚴、雷蚴，最后形成尾蚴，排出螺体，在水面植物叶子上结囊形成囊蚴。囊蚴在草食动物吃草时被吞食，进入动物十二指肠内脱囊成为幼虫。幼虫穿过肠壁进入腹腔，再经肝包膜进入肝脏移行到胆管，在胆管内发育成成虫。幼虫在机体内穿过十二指肠，给肠壁造成机械性损伤；进入腹腔后，穿透肝包膜，在肝脏中穿行，造成肝脏组织创伤。虫体代谢产物的毒性作用、机械性损伤，可导致动物发病甚至死亡。

肝片吸虫病的诊断对于及时治疗病畜、减少死亡和经济损失具有重要的意义。

近年来，国内外学者对肝片吸虫病的诊断进行了研究，特别是一些新的免疫学、分子生物学检测技术的应用，使该病的诊断方面有了较大的进展。

目前，肝片吸虫病的诊断主要包括粪便中虫卵检查、抗原检测和特异性抗体检测。

粪便中虫卵检查是Fh感染检测的常用方法，但是虫体一般都在感染后2-3个月才能成熟排卵，因此，粪便中虫卵检测不适合早期感染的诊断。

粪抗原检测是基于MM3单克隆抗体建立的检测粪便中Fh抗原的ELISA诊断方法，该方法可检测到Fh感染后5周粪便中的抗原，相对于虫卵检测而言，能够更早的检测Fh。

Fh抗体检测方法主要包括变态反应、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)、亲和素-生物素酶联免疫吸附试验(BA-ELISA)等。

Mezo等(2007)和Muino等(2011)制备了抗Fh L1和L2组织蛋白酶的单克隆抗体MM3，利用组织蛋白酶L建立了检测肝片吸虫感染的捕获ELISA，用于动物奶或血清样品的检测。Gottstein等建立了基于鞘脂激活蛋白样蛋白-2的检测肝片吸虫感染的ELISA方法。