[发明专利]一种快速检测肉鸡盲肠淀粉降解细菌的方法

权利要求书

1.一种快速检测肉鸡盲肠淀粉降解细菌的方法，用于提供给饲养人员肉鸡盲肠淀粉降解细菌的信息和数据，以确定肉鸡饲料配方，其特征在于：包括如下步骤：

步骤（1）、样品采集：随机抽取试验鸡，屠宰后剖开鸡腹截取盲肠，清洗，将清洗干净的盲肠放在灭菌锡纸上，剪开肠壁，刮取食糜样品并存于小烧杯中；

步骤（2）、稀释样品：称取大约10 g 步骤（1）的食糜样品，装入无菌过滤袋中，加入经预热的1×PBS缓冲液, 混匀；

步骤（3）、洗脱细胞：将步骤（2）混匀的液体转入到BioRad 匀浆袋中，在BioRad匀浆器高速档匀浆，通过匀浆袋侧边的过滤格过滤；

步骤（4）、收集滤液：匀浆过程完成后, 用无菌的单层纱布过滤食糜样品，滤液收集在无菌离心管中，离心；

步骤（5）、收集沉淀物：去除上清液，并将沉淀物重新悬浮于1×PBS缓冲液中,得到细胞悬浮液，待用；

步骤（6）、盲肠淀粉降解细菌的标定

取上述细胞悬浮液转入到无菌离心管中，离心；去除上清液，加入1×Tris-HCl缓冲液和BODIPY标记的绿色荧光淀粉染液, 立即将混合液体转入到无菌血清瓶中，随后加入灭菌后的电子传递链抑制剂，盖子盖好，并迅速用铝箔包严避光；将包裹好的血清瓶固定在旋转摇床上室温摇动一段时间；将血清瓶转移到暗室，打开血清瓶，吸取混合液涂布于用明胶涂层的载玻片上，避光风干；将上述风干的载玻片置于荧光显微镜载物台上100×的物镜下，通过绿色荧光激发块观察，淀粉降解细菌呈现绿色荧光，记录每一个淀粉降解细菌的位置；

步骤（7）、盲肠淀粉降解细菌的回位鉴定

清洗、干燥载玻片，采用寡聚核苷酸探针，使用FISH，在原位条件下回位鉴定肉鸡盲肠淀粉降解细菌，其中，寡聚核苷酸探针的5’末端采用Cy3染料标记，得到淀粉降解菌的位置；

观察和拍照，根据记录的淀粉降解细菌的位置回位到同一个视野下，通过Cy3激发快观察FISH染色图像，通过红色荧光激发块观察所有FISH染亮的细菌，被绿色荧光淀粉染亮的细菌同时又被寡聚核苷酸探针染亮说明以上述寡聚核苷酸探针为靶标的细菌在肉鸡盲肠中具有降解淀粉的功能；

步骤（8）、肉鸡盲肠淀粉降解细菌的回位定量

清洗、干燥载玻片，用取一定量的DAPI的染液覆盖于风干的载玻片上中央，将载玻片上的DAPI 染液均匀涂开，并置于黑暗的无菌操作箱中染色20-30min，将染液倒去，并用蒸馏水小心冲洗2-3遍，避光并在无菌操作箱中风干，即可在显微镜下镜检；

将干燥好的载玻片置于荧光显微镜物镜台上100×的物镜下进行观察和拍照，根据上面步骤记录的淀粉降解细菌的位置回到同一个视野下，通过DAPI激发快观察DAPI染色图像，通过兰色荧光激发块观察所有细菌；

步骤（9）、盲肠淀粉降解细菌的丰度的确定及统计分析。

2.根据权利要求1所述的快速检测肉鸡盲肠淀粉降解细菌的方法，其特征在于：步骤（1）之前还包括试验鸡的饲养，其中，饲养期包括前期和后期，饲养前期饲料配方如下：

饲料配方包括：玉米 55-60%、玉米豆粕 25-30%、玉米蛋白粉 4-6% 、鱼粉 2-4%、大豆油 1-3% 、磷酸氢钙 1-2% 、细石粉 1-2% 、食盐 0.1-0.5% 、蛋氨酸 0.1-0.2% 、赖氨酸0.1-0.2%、预混料为0.8-1%；饲料营养水平如下：

ME 3000-3100，其单位为KC/kg、CP 20-25%、Ca 1-1.5%、P 0.5-1%、AP 0.3-0.5%、NaCl0.3-0.5%、Lys 1-1.5%、Met 0.3-0.5%、Thr 0.5-1%、Trp 0.2-0.4%、Arg 1-1.1%；

饲料还包括益生元，益生元为菊粉10-40g/Kg和/或溶菌酶40-200mg/Kg。