[发明专利]一种检测胶基型嚼烟对细胞周期影响的方法

权利要求书

1.一种检测胶基型嚼烟对细胞周期影响的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；

步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞HOK于37℃、5%CO2培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为80～90%时移除培养基，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，每25cm2生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1～2mL，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；

步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

步骤（4），细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用口腔角质细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为2 mL /孔接种到细胞培养板中，之后将细胞培养板置于37℃、5%CO2培养箱内培养24h；

步骤（5），受试物暴露：受试物分为两组：细胞对照组和样品测试组；移除步骤（4）中细胞培养皿内的培养基，再按上述方法进行分组，每组多皿；在细胞对照组相应的皿内加入口腔角质细胞培养基；在样品测试组相应的皿内加入口腔角质细胞培养基和步骤（1）所得待测液，至待测液的体积百分浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%；细胞对照组和样品测试组的终体积为2mL/皿；之后置于37℃、5%CO2培养箱中孵育24h；

步骤（6），收集细胞：每孔分别收集细胞，具体的收集方式为：首先收集步骤（6）中的培养液，之后贴壁细胞用0.25%胰酶消化后连同收集的培养液一起离心，弃上清液，收集细胞；

步骤（7），细胞固定：向步骤（6）每孔收集到的细胞中分别加入1ml 预冷至4℃的体积浓度为70%的乙醇，吹打至均匀，4℃固定1h；离心，弃上清，再分别加入500μl预冷至4℃的PBS缓冲液，重悬细胞，再次离心，弃上清，获得细胞；

步骤（8），染色：取每孔经步骤（7）获得的细胞，加入200μl用PBS配制的染液，避光染色30min；染液中RNase酶的浓度为1mg/ml，碘化丙啶染料的浓度为50μg/ml；

步骤（9），流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测，根据获得的DNA荧光强度获得各期细胞比率；

之后，将样品测试组的各期细胞比率与细胞对照组的各期细胞比率相比，如有显著差异，且样品测试组的剂量与样品测试组的各期细胞比率之间有剂量反应关系的，即为阳性结果，该胶基型嚼烟对细胞周期存在影响；

将样品测试组的各期细胞比率与细胞对照组的各期细胞比率相比，如无显著差异，且样品测试组的剂量与样品测试组的各期细胞比率之间无剂量反应关系的，则为阴性结果，该胶基型嚼烟对细胞周期不存在影响。

2.根据权利要求1所述的检测胶基型嚼烟对细胞周期影响的方法，其特征在于，步骤（1）所述的研磨方式具体为：研磨棒顺时针研磨1min后逆时针研磨1min，交替进行，研磨速度为30rpm/min。

3.根据权利要求1所述的检测胶基型嚼烟对细胞周期影响的方法，其特征在于，步骤（1）所述的过滤方法为先用定性滤纸进行初滤，再用0.45μm有机滤膜过滤。

4.根据权利要求1所述的检测胶基型嚼烟对细胞周期影响的方法，其特征在于，步骤（4）所述的细胞培养板为6孔细胞培养板。

5.根据权利要求1所述的检测胶基型嚼烟对细胞周期影响的方法，其特征在于，步骤（5）分组时，样品测试组的各个浓度和细胞对照组均设置3个复孔。

6.根据权利要求1所述的检测胶基型嚼烟对细胞周期影响的方法，其特征在于，步骤（6）、步骤（7）所述的离心的速度均为1000rpm/min，每次离心时间均为5min。