[发明专利]MicroRNA 378 (MIR378)核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

说明书

本发明为一种microRNA 378(MIR378)核酸定量检测试剂盒（PCR‑荧光探针法）。通过RT‑PCR的方法，将样品中的RNA逆转录得到相应的cDNA，再利用特定的引物和探针，结合实时荧光定量PCR检测技术，可以准确检测样本中microRNA 378(MIR378)的表达量。此种检测方法可以对胃癌患者的外周血血清样本中的microRNA 378(MIR378)进行定量分析，临床上可以用以辅助诊断和评价预后的治疗效果。本发明通过分子学上的医学检测手段来指导临床治疗，具有一定的临床价值。

技术领域

本发明属于生物技术人领域，为通过逆转录（RT）RNA样品得到cDNA，现结合实时荧光定量PCR技术，可以精确定量检测标本中人microRNA 378 (MIR378)表达量的试剂盒。

背景技术

据中国肿瘤登记中心的数据显示，2015年中国新增430万癌症病例，癌症死亡病例超过281万，占据全年死亡人数比例的28.82%，居于世界首位，即平均每天就有超过7500人死于癌症。胃癌是常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于胃癌。其发病率和死亡率各国差异很大。我国是世界上胃癌高发地区之一，每年平均病死约15万人。男多于女，发病年龄多在40岁以上。

现今，胃癌是已成为人类健康的重大威胁。目前, 手术切除、化疗、放疗及内分泌治疗依然是胃癌治疗的主要方法。在上述技术已经达到相当成熟和普及的同时，高复发和转移率也依然是胃癌患者面临的主要问题，这些问题的出现对患者的有效生存期起着重要的影响，严重危害着肿瘤患者术后的生活质量。那么如何在患者术后检测其肿瘤的复发和转移成了众多学者的研究课题。2000年以后，很多学者都在研究将分子生物学领域应用到人类健康课题上来，至今已经十几年，由此而发展的体外检测技术也在不断成熟和完善中。其中TaqMan荧光定量PCR就是其中的一种体外诊断技术。

由于TaqMan荧光定量PCR具有重复性好，结果准确可靠的特点，所以在医学检测方面，一些常规检测方法所不能解决的问题可以以此解决。 一般来说细胞形态学检查可直接观测到肿瘤细胞，但仅限于组织的病理检测。由于肿瘤脱落至血循环中的数目微小，这种检查的敏感性和特异性均较差，阳性率仅为1%。后期的免疫组织化学方法提高了检出率，但该技术生产复杂，且需要特异性的抗体，而且假阳性率也高。TaqMan荧光定量PCR与这些技术相比，有着明显的优点，由于有些肿瘤可转录特异性mRNA，但无相应蛋白合成，故荧光定量PCR应用范围较蛋白广泛；另外只要知道待测基因序列，即可设计合成引物探针进行逆转录及扩增，操作方便；同时该方法具有较高的灵敏度及可重复性，保证了医学检测结果的准确性。

以microRNA 378 (MIR378)检测为例，microRNA 378 (MIR378)是胃癌的特异性的生物标志物，在健康人外周血中含量很低或检测不到microRNA 378 (MIR378)，而在复发和转移的胃癌患者中，如果癌细胞脱落于血液中，在血清或血浆中就会产生microRNA 378(MIR378)，便可以检测到。与此同时，TaqMan荧光定量PCR技术具有很好的灵敏性和特异性，有针对性的对胃癌患者外周血及肿瘤组织﹑骨髓等样本中的microRNA 378 (MIR378)的表达进行检测，便可以对胃癌细胞血行播散等诊断提供重要的依据。所以该技术的应用，将会对早期胃癌患者的诊断、指导临床治疗、改善患者预后产生极为重要的作用。

发明内容

本发明为一种microRNA 378 (MIR378)核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法），含有4种组分，分别为： 一步法RT-PCR反应液（360μL/管），阳性对照品（50μL/管）、阴性对照品（50μL/管）、2×10⁶copies/µl标准品（20μL/管）主要成份组成。