[发明专利]用于测定核苷酸序列的方法

权利要求书

1.通用尾部接头和一组引物在制备用于通过如下方法测定与已知靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列的组合产品中的用途，所述方法包括：

(a)将双链靶核酸连接至所述通用尾部接头，其中，

所述通用尾部接头包含(i)扩增链和(ii)封闭链，所述扩增链包含未配对5’部分、3’双链部分和3’T突出，所述封闭链包含5’双链部分，

所述扩增链和所述封闭链的所述双链部分为100％互补，并形成所述通用尾部接头的可连接双链末端，

所述扩增链连接至所述双链靶核酸的第一链的5’末端，并且

所述第一链包含所述已知靶核苷酸序列；

(b)用第一接头特异性引物和第一靶引物扩增包含所述已知靶核苷酸序列的所述第一链的一部分和所述通用尾部接头的扩增链，所述第一接头特异性引物包含与所述扩增链的一部分相同的序列，所述第一靶引物特异性退火至所述已知靶核苷酸序列；

(c)用第二接头特异性引物和第二靶引物扩增由步骤(b)产生的扩增子的一部分，其中，所述第二靶引物包含3’部分，所述3’部分含有能特异性退火至由步骤(b)产生的扩增子所包含的所述已知靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，其中，所述第二靶引物相对于所述第一靶引物嵌套；以及

(d)使用第一测序引物或第二测序引物对由步骤(c)产生的扩增子的一部分进行测序。

2.如权利要求1所述的用途，其中，所述双链部分足够长，以在连接温度下维持双链形式。

3.如权利要求1所述的用途，其中，所述第二接头特异性引物相对于所述第一接头特异性引物嵌套。

4.如权利要求1所述的用途，其中，所述第二接头特异性引物通过至少3个核苷酸相对于所述第一接头特异性引物嵌套。

5.如权利要求1所述的用途，其中，所述扩增链包含与第一测序引物和第二测序引物相同的核酸序列。

6.如权利要求1所述的用途，其中，所述扩增链的所述未配对5’部分含有与所述第一测序引物或所述第二测序引物相同的核酸序列。

7.如权利要求1所述的用途，其中，所述第一靶引物进一步包含高GC含量的5’标签序列，所述高GC含量的5’标签序列不与(b)、(c)或(d)中使用的引物互补或不同于(b)、(c)或(d)中使用的引物。

8.如权利要求1所述的用途，其中，所述第二靶引物包含5’部分，所述5’部分含有与所述第二测序引物相同的核酸序列；以及其中，所述第一接头特异性引物包含与所述第一测序引物的5’部分相同的核酸序列。

9.如权利要求1所述的用途，其中，所述第二接头特异性引物包含所述第一测序引物的核酸序列。

10.如权利要求9所述的用途，其中，所述第二接头特异性引物与全长第一测序引物相同。

11.如权利要求1所述的用途，其中，特异性退火至所述已知靶核苷酸序列的所述靶引物的部分在PCR缓冲液中在65℃的温度下退火。

12.如权利要求1所述的用途，其中，通过下一代测序法对由步骤(c)产生的所述扩增子的一部分进行测序。

13.如权利要求12所述的用途，其中，所述下一代测序法包括选自于由以下方法所组成的组中的方法：

Ion Torrent、SOLiD、454、大规模平行签名测序、固相可逆染料终止物测序、以及DNA纳米球测序。

14.如权利要求13所述的用途，其中，所述第一测序引物和所述第二测序引物兼容所选的下一代测序法。

15.如权利要求1所述的用途，其中，所述方法包括将所述靶核酸或所述靶核酸的单独部分与多组第一靶引物和第二靶引物接触。