[发明专利]一种NAD类似物偏好型氧化还原酶的筛选方法

权利要求书

1.一种NAD类似物偏好型氧化还原酶的筛选方法，其特征在于：以亚磷酸敏感微生物为宿主，构建同时表达NAD类似物偏好型亚磷酸脱氢酶和NAD类似物供给功能蛋白的平台菌株；利用氧化还原酶突变体表达系统转化平台菌株细胞，并将转化子在含有亚磷酸的环境中培养，所得生长正常的转化子过表达的氧化还原酶即具备识别NAD类似物的特性。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述NAD类似物为烟酰胺胞嘧啶二核苷酸，烟酰胺胸腺嘧啶二核苷酸，烟酰胺尿嘧啶二核苷酸，或烟酰胺鸟嘌呤二核苷酸中的一种或两种以上。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述亚磷酸敏感微生物为在不能代谢亚磷酸的微生物，包括原核微生物大肠杆菌，真核微生物为酿酒酵母、衣藻中的一种或两种。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述亚磷酸化合物浓度为1.0mM-500mM。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述NAD类似物供给功能蛋白为NAD类似物转运蛋白或具有NAD类似物合成能力的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体；

所述NAD类似物转运蛋白为具备将NAD类似物转运至胞内的活性蛋白，包括衣原体来源的NAD转运蛋白NTT4或拟南芥来源的NAD转运蛋白AtNDT4中的一种或两种；

所述具有NAD类似物合成能力的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，包括来源于Francisella tularensis的NadM突变体NadM-H110R/N132Y/F136K，NadM-K112Y/Y133E，来源于E.coli的NadD突变体NadD-P22G/Y84A/C132D，NadD-L26F/T85G/T174V，来源于E.coli的NadR突变体NadR-L83R/I206P或NadR-A87L/S207E中的一种或两种以上。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述NAD类似物偏好型亚磷酸脱氢酶为野生亚磷酸脱氢酶经基因工程突变得到的突变体，包括来源于Ralstonia sp.Strain 4506的亚磷酸脱氢酶rPDH突变体rPDH-I151R，rPDH-I151R/P176D，rPDH-I151R/M207A，rPDH-I151R/P176Q/M207G，来源于Pseudomonas stutzeri WM88亚磷酸脱氢酶psPDH的突变体psPDH-L151R或psPDH-L151R/D213E中的一种或两种以上。

7.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述的氧化还原酶为可催化转化还原型辅酶NADH或NADPH，生成氧化型辅酶NAD或NADP的酶，包括但不局限于NADH或NADPH依赖型催化底物还原的酶，羰基还原酶，氧化还原蛋白还原酶，还原羧化酶，氰基或过氧化物还原酶；NADH或NADPH依赖型催化底物氧化的单加氧酶；

羰基还原酶包括但不局限于乳酸脱氢酶，β-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶；还原羧化酶为苹果酸酶；氰基还原酶为7-氰基-7-碳鸟嘌呤还原酶，过氧化物还原酶为过氧氢化脂肪酸还原酶；氧化还原蛋白还原酶包括但不局限于铁-硫蛋白还原酶，甲苯-2,3-双加氧酶还原酶；单加氧酶包括但不局限于细胞色素P450单加氧酶P450_BM3，苯乙烯单加氧酶或环己烷酮单加氧酶。

8.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述氧化还原酶突变体表达系统，为携带氧化还原酶突变体编码基因的表达载体或表达盒中的一种或两种；

氧化还原酶突变体包括但不局限于乳酸脱氢酶V152X/I177X，β-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶G186X/V328X，P450单加氧酶P450_BM3V901X/R966X/T974X/W1046X，苹果酸酶Q401X，过氧氢化脂肪酸还原酶G21X/V133X，苯乙烯单加氧酶P152X/I184X/T210X，铁-硫蛋白还原酶S182X/N223X/M226X，甲苯-2,3-双加氧酶还原酶M144X/V149X，X为20种常见氨基酸的任何一种。

9.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所得NAD类似物偏好型氧化还原酶突变体，应用于构建基于NAD类似物的氧化还原代谢途径和工程菌株。