[发明专利]特异性高表达棕榈酰化缺失MTDH的MDA-MB-231细胞株及构建方法

权利要求书

1.一种内源MTDH敲除而棕榈酰化缺失MTDH特异性高表达的MDA-MB-231细胞株的构建方法，其特征在于：以乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞作为宿主细胞，通过CRISPR/Cas9基因敲除和突变基因过表达两步实现敲除野生型MTDH而表达突变型MTDH；所述突变后MTDH基因序列如下：

ATGGCTGCACGGAGCTGGCAGGACGAGCTGGCCCAGCAGGCCGAGGAGGGCTCGGCCCGGCTGCGGGAAATGCTCTCGGTCGGCCTACCCTTTCTGCGCACCGAGCTGGGCCTCGACCTGGGGCTGGAGCCGAAACGGTACCCCGGCTGGGTGATCCTGGTGGGCACTGGCGCGCTCGGGCTGCTGCTGCTGTTTCTGCTGGGCTACGGCTGGGCCGCGGCTAGTGCCGGCGCCCGCAAAAAGCGGAGGAGCCCGCCCCGCAAGCGGGAGGAGGCGGCGGCCGTGCCGGCCGCGGCCCCCGACGACCTGGCCTTGCTGAAGAATCTCCGGAGCGAGGAACAGAAGAAGAAGAACCGGAAGAAACTGTCCGAGAAGCCCAAACCAAATGGGCGGACTGTTGAAGTGGCTGAGGGTGAAGCTGTTCGAACACCTCAAAGTGTAACAGCAAAGCAGCCACCAGAGATTGACAAGAAAAATGAAAAGTCAAAGAAAAATAAGAAGAAATCAAAGTCAGATGCTAAAGCAGTGCAAAACAGTTCACGCCATGATGGAAAGGAAGTTGATGAAGGAGCCTGGGAAACTAAAATTAGTCACAGAGAGAAACGACAGCAGCGTAAACGTGATAAGGTGCTGACTGATTCTGGTTCATTGGATTCAACTATCCCTGGGATAGAAAATACCATCACAGTTACCACCGAGCAACTTACAACCGCATCATTTCCTGTTGGTTCCAAGAAGAATAAAGGTGATTCTCATCTAAATGTTCAAGTTAGCAACTTTAAATCTGGAAAAGGAGATTCTACACTTCAGGTTTCTTCAGGATTGAATGAAAACCTCACTGTCAATGGAGGAGGCTGGAATGAAAAGTCTGTAAAACTCTCCTCACAGATCAGTGCAGGTGAGGAGAAGTGGAACTCCGTTTCACCTGCTTCTGCAGGAAAGAGGAAAACTGAGCCATCTGCCTGGAGTCAAGACACTGGAGATGCTAATACAAATGGAAAAGACTGGGGAAGGAGTTGGAGTGACCGTTCAATATTTTCTGGCATTGGGTCTACTGCTGAGCCAGTTTCTCAGTCTACCACTTCTGATTATCAGTGGGATGTTAGCCGTAATCAACCCTATATCGATGATGAATGGTCTGGGTTAAATGGTCTGTCTTCTGCTGATCCCAACTCTGATTGGAATGCACCAGCAGAAGAGTGGGGCAATTGGGTAGACGAAGAAAGAGCTTCACTTCTAAAGTCCCAGGAACCAATTCCTGATGATCAAAAGGTCTCAGATGATGATAAAGAAAAGGGAGAGGGAGCTCTTCCAACTGGGAAATCCAAAAAGAAAAAAAAGAAAAAGAAGAAGCAAGGTGAAGATAACTCTACTGCACAGGACACAGAAGAATTAGAAAAAGAGATTAGAGAAGACCTTCCAGTGAATACCTCTAAAACCCGTCCAAAACAGGAAAAAGCTTTTTCCTTGAAGACCATAAGCACTAGTGATCCAGCCGAAGTACTCGTCAAAAATAGCCAGCCTATCAAGACTCTTCCACCTGCTACTTCTACCGAGCCATCTGTAATCTTATCAAAAAGTGATTCTGACAAGAGCTCTTCCCAAGTGCCGCCAATACTACAAGAGACAGATAAATCCAAGTCAAATACCAAGCAAAATAGTGTGCCTCCTTCACAGACCAAGTCTGAAACTAGCTGGGAATCTCCCAAACAAATAAAAAAGAAGAAAAAAGCCAGACGAGAAACGTGA；

所述构建方法包括以下步骤：

1)将野生型MTDH的sgRNA序列连至Lentivirus V2慢病毒载体中，得sgMTDH载体；

2）转染前24~48 h将用于慢病毒包装的细胞HEK293T接种于细胞培养皿；

3）在HEK293T细胞中以1:9:10的质量比例转染4~6μg包装质粒及病毒质粒，分别为pVSV-G : pSPAX2 : sgRNA,包含sgControl及sgMTDH；

3) 转染8~12 h后吸去培养基并加入10ml DMEM培养基；

4) 感染前24~48 h将靶细胞MDA-MB-231接种于dish以使感染时细胞密度达到50%左右；

5) 转染后48~72 h，将上清放入离心管中，3000 rpm转离心10分钟，吸取上清并用0.45μm的滤膜过滤，得到所需病毒液，加入到待感染的MDA-MB-231细胞中并同时加入终浓度5 μg/ml polybrene；

6) 感染的MDA-MB-231细胞培养8~24 h后吸去培养基，换用DMEM培养基转至dish中，继续培养；

7) 用含3~8 μg/ml puromycin的DMEM培养基换液对细胞进行筛选，48 h后将存活的细胞挑取单克隆放入96孔板培养至足够数量后，提取蛋白，通过Western blot检测MTDH的表达量；

8）使用点突变的方式在MTDH基因序列中进行两次定点突变；首先在编码棕榈酰化位点Cys75的基因序列处设计突变引物，使Cys75密码子TGC突变为AGT，进一步将所设计sgRNA序列附近的PAM序列AGG突变为ACC，避免CRISPR/Cas9系统对外源表达MTDH的敲除，将双突变的MTDH序列连至pLoc过表达载体中，得pLoc-MTDH-C75S-AGG87ACC；

9）转染前24~48 h将用于慢病毒包装的细胞HEK293T接种于细胞培养皿；

10）在293T细胞中以1:9:10的比例转染5 μg包装质粒及病毒质粒，分别为pVSV-G :pSPAX2 : 过表达载体pLoc-MTDH-C75S-AGG87ACC；

11) 转染8-12 h后吸去培养基并加入DMEM培养基；

12) 病毒感染前24~48 h将之前筛选MTDH成功敲除的MDA-MB-231细胞接种于dish以使实验时细胞密度达到50%左右；

13) 转染后48~72 h，将含有病毒的DMEM培养基转移至离心管中，3000rpm转离心10分钟，吸取上清并用0.45 μm的滤膜过滤，得到所需病毒液，加入到待感染的MTDH敲除的MDA-MB-231细胞中并同时加入终浓度5 μg/ml polybrene；

14) 病毒干扰8~24 h后吸去含病毒的培养基，换用DMEM培养基继续培养24~48 h；

15) 用含10~20 μg/ml BSH的培养基换液对细胞进行筛选，提取细胞RNA，反转录后检测其中MTDH mRNA序列；提取蛋白，通过Western blot检测MTDH的表达量。