[发明专利]一种化合物皮肤致敏体外评估细胞模型及其构建方法

说明书

本发明公开一种化合物皮肤致敏体外评估细胞模型及其构建方法。该细胞模型的构建方法包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9设计并构建sgRNA表达载体；设计并构建能将连接自裂解肽序列的报告基因定点敲入HMOX1基因的表达框内的同源重组载体；将同源重组载体，与hCas9质粒、sgRNA表达载体共转染细胞，进行单克隆化扩大培养，即得细胞模型。本发明通过CRISPR/CAS9结合细胞单克隆技术，获得HMOX1基因终止密码子前敲入荧光素酶基因的HaCaT细胞模型。该细胞模型实现荧光素酶基因与HMOX1基因的同步表达，从而有效分辨致敏化合物和非致敏化合物，为化合物致敏性研究提供更特异，更灵敏的细胞模型。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种化合物皮肤致敏体外评估细胞模型及其构建方法，特别涉及一种CRISPR/CAS9介导HMOX1基因靶向性敲入报告基因的细胞模型及其方法。

背景技术

皮肤致敏是一种由皮肤接触诱发物导致的迟发性超敏反应，致敏化合物与内源蛋白结合形成半抗原，引起皮肤树突细胞激活及角质细胞系列反应，进而激活T细胞，导致淋巴结增生及机体皮肤炎症反应，这一过程也称皮肤致敏有害结局路径AOP。

皮肤致敏的动物实验主要有豚鼠皮肤实验和小鼠局部淋巴结试验(local lymphnode assay，LLNA)，其中示踪剂改良版的LLNA:BrdU ELISA成为应用最为广泛的全球标准方法，也是目前我国皮肤致敏评价的主要方法。但是随着国际社会对实验动物福利伦理及3R原则的不断推行，且动物皮肤反应与人亦存在差异，替代动物的体外皮肤致敏评价方法研发迫在眉睫。由于皮肤致敏有害结局路径AOP已经比较清晰，因此基于AOP的关键步骤，开发模拟体内致敏过程的系统模型，是目前国内外体外替代方法研发的基本策略。其中模拟致敏过程细胞反应的关键事件，建立荧光素酶报告细胞模型是致敏评估准确高效性及实现高通量的重要手段。

目前国内外较为认可的报告细胞模型多集中在角质细胞及树突状细胞激活路径两个水平，包括针对Keap1-Nrf2-ARE通路的KeratinoSensTM、LuSens、ARE-bla HepG2、HMOX1-Luciferase等模型及评估IL-8表达的THP-G8细胞，其中KeratinoSens^TM已成为OECD指导原则，LuSens和THP-G8也已得到欧洲ECVAM认可。以上报告细胞模型均是通过将靶基因调控元件与荧光素酶基因组合，通过荧光素酶表达间接反应靶基因表达。KeratinoSens^TM细胞的调控元件为SV40与人AKR1C2基因的ARE元件组合，同样LuSens细胞的ARE调控元件来自大鼠NQO1基因，两个细胞模型的评估准确率分别可高达75～96％和71～85％。类似方法跟踪IL-8细胞表达的THP-G8细胞准确率高达82％。部分细胞模型的检测准确率甚至高于小鼠局部淋巴结实验LLNA，表明基于AOP的报告细胞是LLNA的体外有效替代方法。

但是这些报告细胞模型仅仅间接反应靶基因表达，而非真正意义的实时报告基因表达。模型实质为调控元件-荧光素酶随机插入的转基因细胞，虽然细胞在一定程度上可通过荧光素酶的表达间接评估靶基因的表达，但是并非真正意义的同步追踪内源基因表达的报告细胞，导致模型仅可评估化合物是否致敏，难以定量评估致敏强弱。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种CRISPR/CAS9介导HMOX1基因靶向性敲入报告基因的细胞模型的构建方法。

本发明的另一目的在于提供上述CRISPR/CAS9介导HMOX1基因靶向性敲入报告基因的细胞模型。

本发明的再一目的在于提供上述CRISPR/CAS9介导HMOX1基因靶向性敲入报告基因的细胞模型的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种CRISPR/CAS9介导HMOX1基因靶向性敲入报告基因的细胞模型的构建方法，包括如下步骤：