[发明专利]一种防止烟草外植体褐化的方法

说明书

本发明是一种防止烟草外植体褐化的方法，包括如下步骤：植物种子的消毒、植物种子培养、外植体预培养、外植体组织培养后进行外植体愈伤组织防褐化培养，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30‑50μmol/(m2·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为40天。所述的防褐化培养基为：MS基本培养基中加入防褐添加剂4‑8mg/L柠檬酸，0.2‑0.5g/L聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，30g/L蔗糖，4g/L琼脂，培养基的pH值为5.7，121℃灭菌15min。褐化培养处理后，可以有效缓解褐化现象，改善外植体整体的分化状态。添加柠檬酸和聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)在培养基中，具有使用方便、成本低、效果好等优点。

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种用含有柠檬酸和聚乙烯基吡咯烷酮的培养基防止烟草外植体褐化的方法。

背景技术

褐化是植物组织培养过程中产生的一种常见的不利现象，是近几年植物组培方面的研究热点之一。

影响褐化的内因包括外植体材料的生理状态、基因型、生长环境、营养状况、生长部位和年龄等；外因包括培养基的成分、外加激素的种类含量及比例、吸附剂、抗褐化剂、有无热激处理、培养条件温度、pH、光照时间、光照强度、通气状况等也会影响褐化的发生。在导致褐化的诸多因素中，膜结构的破坏或细胞中物质区域化分布的破坏是酚类物质的酶促氧化和组织发生褐化的关键[1]。当外植体组织被切割后，切口附近的细胞受到伤害时，酚、酶的分隔效应被打破，细胞内酚类化合物向外分泌、酚氧化酶释放或合成。在合适的pH、温度等条件下，在酚氧化酶的作用下，酚类物质(底物) 和氧气发生氧化反应，形成褐色醌类物质，这使切面迅速变成棕褐色或暗褐色。这种褐色物逐渐在培养基中扩散，抑制其它酶的活性，毒害整个外植体组织，外植体随之进一步变褐而最终死亡。

烟草是茄科烟草属的一年生草本植物，本属约有60种。原产于美洲和大洋洲，中国栽培4种：烟草、黄花烟草、光烟草和花烟草，其中烟草种植面积最大。烟草具有药用、工业用、保腱美容等价值。此外，烟草作为植物组织培养的“模式植物”之一，在植物细胞工程的研究中占有重要地位。有关烟草组织和细胞培养有不少研究和报道。褐化这一在许多木本植物组培中常见的现象，也是烟草组织培养的一大障碍。

研究表明，可通过控制相关的生物因素、培养基种类和成分，以及添加一定的吸附剂或抗褐化剂达到减轻褐化的效果。

本发明利用在培养基中添加防褐剂柠檬酸和聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)缓解烟草外植体褐化，相关方法未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种防止烟草外植体褐化的方法，该方法可以对植物组培过程中出现的褐化问题得到有效缓解，进而对植物组织培养具有重要作用。

本发明解决技术问题的方案如下：

一种防止烟草外植体褐化的方法，包括如下步骤：

步骤1：植物种子的消毒：取饱满的烟种子移至超净工作台上，用75％酒精将植物种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1％AgNO3消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干植物种子表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水；

步骤2： 植物种子培养：将步骤1的植物种子接种到MS培养基中，在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16小时/天的条件下培养60天，种子发芽长成外植体幼苗；所述MS培养基为MS基本培养基加30g/L蔗糖加4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7 ；