[发明专利]一种白顶溪鸲线粒体控制区扩增嵌套引物及扩增、克隆和测序方法

说明书

本发明公开了一种白顶溪鸲线粒体控制区扩增嵌套引物及扩增、克隆和测序方法，属于生物技术领域，本发明采用6组扩增嵌套引物对白顶溪鸲线粒体控制区进行2次PCR扩增，第一轮PCR的产物可直接进行测序，第二轮PCR扩增出的片段结合琼脂糖凝胶回收纯化快速克隆技术可以大大提高测序模板的纯度和浓度，以消除测序过程中的异质性，有效攻克了多聚核苷酸序列导致测序失败的难题，直接测序结合克隆测序大大减轻了操作者的工作负担，本发明采用扩增嵌套引物二级结构少，构象稳定，6种嵌套引物的3’末端均避免了A碱基的引入从而大大降低非特异性扩增的风险。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及扩增、克隆技术领域，具体涉及一种白顶溪鸲线粒体控制区扩增嵌套引物及扩增、克隆和测序方法。

背景技术

白顶溪鸲(Chaimarrornis leucocephalus)作为一种重要的野生鸟类，分布范围广，通过分子手段对其生物多样性进行研究有利于指导白顶溪鸲野生资源的保护。

白顶溪鸲在分类学上属于雀形目鹟科，其种类繁多、形态多样、分布广泛；关于该科各属间或属内的鸟类的系统发育关系存在着较大的争议。相对于核基因组而言，鸟类线粒体基因组在进行系统发育分析时具有如下优势：分子量小、基因排列紧密、严格的母系遗传、无组织特异性和进化速率快等，因此，线粒体DNA已被广泛作为分子标记用于鸟类系统发育关系的研究。其中线粒体控制区(control region)，又称D-loop，是线粒体基因组中最长的非编码区域，对线粒体DNA的复制和转录起始进行调控。由于线粒体控制区序列变化较大，可以作为群体遗传学理想的分子标记去研究白顶溪鸲的种群特征。

白顶溪鸲的线粒体控制区中存在大量多聚核苷酸串联重复序列，在DNA的测序过程中，测序反应有效读长在600-800bp，而这种重复出现的多聚核苷酸序列能引起DNA二级构象发生改变，造成测序无法正常延伸、信号提前衰竭，测序反应中断导致测序失败。同时由于线粒体DNA存在高度甲基化，PCR引物有可能特异性很差，不适合进行测序，导致测序失败，无法获得用于研究的分子数据。上述两点技术难题为开展以白顶溪鸲为例的鶲科鸟类线粒体控制区研究带了极大的困难，其困难主要体现在：用于扩增的特异性引物、扩增方法、克隆方法和测序过程四个方面。

发明内容

根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种白顶溪鸲线粒体控制区扩增嵌套引物及扩增、克隆和测序方法，为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种白顶溪鸲线粒体控制区扩增嵌套引物，所述的扩增嵌套引物包括SEQ IDNO.1-6所示的特异性嵌套引物，其中，

SEQ ID NO.1：ATCTCCAACTCCCAAAGCT；

SEQ ID NO.2：CAAACTGGGATTAGATACC；

SEQ ID NO.3：TCTCACGAGAACCGAGCTAC；

SEQ ID NO.4：ATCTTCCTCTTGACATGTCC；

SEQ ID NO.5：GGTATTTTCAACTAAACTACTT；

SEQ ID NO.6：AGGGTATGTACTCTCTGCATCG。

优选的，所述扩增嵌套引物由通用生物系统有限公司安徽厂合成，浓度为5μmol。

一种采用所述扩增嵌套引物扩增白顶溪鸲线粒体控制区的方法，具体步骤如下：

1)样品取材：取白顶溪鸲的肌肉，编号K0017；