[发明专利]一种基于活性炭和柠檬酸的烟草外植体防褐化方法

说明书

本发明涉及一种基于活性炭和柠檬酸的烟草外植体防褐化方法，包括如下步骤：步骤（1），种子的消毒；步骤（2），种子培养；步骤（3），烟草外植体预培养；步骤（4），烟草外植体组织培养；步骤（5），外植体防褐化培养；本发明将多种防褐化手段有效结合，彼此作用，不仅防褐化效果更佳，还使得生根天数大幅度缩短，外植体褐化率为9.9‑15.9%，外植体7‑10天生根，培养40‑46天，根长＞1cm，根数≥2条，效果良好。

技术领域

本发明涉及一种烟草外植体防褐化方法，具体是一种基于活性炭和柠檬酸的烟草外植体防褐化方法，属于植物组织培养领域。

背景技术

烟草是一种经济价值较高的作物，在我国占有巨大的经济市场。烟草除主要用于吸食、蛋白食用和药用外，还具有广泛的用途。随着植物科学的发展，烟草作为基础研究和应用中的模式作物在植物遗传、发育、生理生化和此生代谢研究等方面发挥了重要的作用。但是烟草外植体在组织培养过程中的褐化问题是多发的常见的，几乎不可避免，所以防止褐化是在烟草组织培养中要极力解决的问题。

产生褐化现象的外植体仍能生长并生根，但增殖速度和生根率受到明显影响，情况严重还会导致外植体基部逐渐褐化并危及其生存。由于褐化现象只出现在少数组培苗中，而且与外植体材料的生理状态有一定的关系，因此在外植体选材时需尽量选取幼嫩的生长旺盛的外植体，继代过程中需要抛弃老枝部分，只将新生部分继代，这样可以减少部分褐化现象，但是这种操作所培养出的组培苗数量较少，不适宜大规模的生产。

克服烟草外植体褐化的方法主要有：接种前用抗氧化剂短时间浸泡外植体；培养基添加抗褐化剂（抗氧化剂、抗氧化酶活性促进剂和酚类物质吸附剂）；外植体热激处理（45-50℃抑杀多酚氧化酶、苯并氨酸酶），培养物多次转移到新鲜培养基。然而，这些方法虽然能起到一定的防褐化作用，但是效果不显著。

针对烟草外植体，需要探索一种效果更好的防褐化方法。

发明内容

为了解决上述为问题，本发明的目的在于提供一种基于活性炭和柠檬酸的烟草外植体防褐化方法，可有效缓解烟草组培过程中出现的褐化问题。

本发明采用解决技术问题方案如下：

一种基于活性炭和柠檬酸的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤（1），种子的消毒；

步骤（2），种子培养：将步骤（1）得到的种子接种到MS培养基中培养，种子发芽长成外植体幼苗，然后用浸泡过生土豆的水涂覆外植体幼苗表面；种子的培养条件为：在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d；

步骤（3），烟草外植体预培养：将步骤（2）中得到的外植体幼苗转移并接种于添加有10-15g/L核桃粒且包括有MS基本培养基、4g/L琼脂、30g/L蔗糖的MS预培养固体培养基中培养，控制温度为24℃，光照强度为1500lux，光照时间为10小时/天，培养时间为3天，最后将得到预培养后的外植体，反复接种于MS培养基4-5次，使组织中的酚类物质部分渗入培养基；

步骤（4），烟草外植体组织培养：将步骤（3）中得到的外植体置于MS分化培养基中培养，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为7天，得到外植体愈伤组织；

步骤（5），外植体防褐化培养：将步骤（4）中得到的外植体置于MS防褐化培养基中，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为40天；MS防褐化培养基为MS基本培养基中添加0.3-1.0g/L活性炭、4-8mg/L柠檬酸、30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。