[发明专利]一种梨S7-RNase蛋白的体外表达方法及其多克隆抗体的制备方法

说明书

本发明公布了一种梨S₇‑RNase蛋白的体外表达及其多克隆抗体的制备方法。通过设计引物克隆梨S₇‑RNase基因；构建大肠杆菌重组表达载体S₇‑cutSignalP‑pCold‑TF；将构建的重组表达载体S₇‑cutSignalP‑pCold‑TF转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，构建表达梨S₇‑RNase蛋白的重组菌株；对重组菌株进行表达，并用镍柱亲和层析发纯化重组梨S₇‑RNase蛋白；以纯化的重组梨S₇‑RNase蛋白为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备梨S₇‑RNase多克隆抗体。通过本发明的方法，实现了梨S₇‑RNase蛋白的体外表达并制备出了效价高、特异性好的梨S₇‑RNase多克隆抗体，完全可以满足相关实验的需求。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种梨S₇-RNase蛋白的体外表达方法及其多克隆抗体的制备方法。

背景技术

梨自交不亲和性是被子植物中普遍存在的限制自花受精的机制之一，它阻止基因型相同的花粉管在雌蕊中正常的生长，完成受精。梨自交不亲和性为基于S-RNase的配子体型自交不亲和反应，众多果树如苹果、杏、果梅等，都表现出此现象。由于梨树自花授粉不能结实，在生产上必须配置授粉树，或进行人工授粉才能保证座果，增加了农民的生产成本。因此，梨自交不亲和性机制的研究具有理论价值和实践价值的双重意义。近30年来，国内外对于梨自交不亲和性机制进行了很多研究，面临的首当其冲的问题就是S-RNase的提取，而由于材料的来源、保存和繁琐的蛋白提取过程等问题，给研究带来了很大的阻力。所以利用基因工程技术制备重组梨S-RNase蛋白是解决上述问题的一个有效途径。

利用基因工程技术制备重组蛋白是一种具有广阔前景的技术手段。到目前为止，已有多种蛋白质表达系统，如原核表达系统、真核表达系统、无细胞表达系统等。大肠杆菌表达系统是最常用的一种原核表达系统，相比传统从活体材料中提取蛋白的方法，该系统具有遗传背景和生化特性清楚、生长快、成本低、表达量高、表达产物分离纯化相对简单和便于大规模生产等优点。长期以来，已有无数成功表达重组蛋白的案例。与此同时，S-RNase作为梨自交不亲和性反应的重要影响因子，市场上还没有效价高、特异性好的针对性抗体，故为了进一步研究S-RNase在梨自交不亲和性反应中的作用及其他相关生物学功能，本专利拟制备兔源抗梨S₇-RNase蛋白抗体。

发明内容

本发明的目的是提供一种低成本、高产率、易纯化的梨S₇-RNase蛋白体外表达的制备方法。

本发明的另目的是提供一种效价高、特异性好的梨S₇-RNase蛋白多克隆抗体的制备方法。

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：

一种梨S₇-RNase蛋白体外表达的方法，包括以下步骤：

a.提取梨花柱总RNA，反转录成cDNA，设计引物PCR扩增梨S₇-RNase基因；

b.构建表达梨S₇-RNase蛋白的原核重组表达载体；

c.将步骤b构建的原核重组表达载体转化到大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)中，构建S₇-RNase重组表达菌株；

d.培养步骤c所构建的S₇-RNase重组表达菌株至OD₆₀₀达到0.4-0.6，并低温处理后，加入诱导剂IPTG，诱导表达梨S₇-RNase蛋白；

e.纯化诱导表达的梨S₇-RNase蛋白。