[发明专利]基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体、细胞及方法

说明书

本发明公开了一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体、细胞和方法。本发明提供的载体包括阻遏蛋白TetR表达载体和含有操纵基因TetO的双向表达载体，在融合前将两者共转染到供体细胞中。筛选阳性转染的细胞，药物诱导表达山羊TET3，将TET3诱导表达的阳性细胞作为最终供体细胞，再将其注入到去核后的卵母细胞并进行电融合，挑选成功融合的山羊体细胞克隆胚培养。本发明可以有效的降低供体细胞的甲基化水平，纠正克隆胚胎中的异常高甲基化现象，从而显著提高后期山羊体细胞克隆胚胎的发育率和质量，可以高效地体外生产山羊体细胞克隆胚胎，胚胎移植后的克隆山羊的出生率也显著提高。

技术领域

本发明属于动物体细胞克隆技术领域，涉及一种基于供体细胞甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体、细胞及方法。

背景技术

体细胞克隆是一种具有巨大研究和商用价值的技术，可应用到治疗性克隆、疾病模型、人器官移植、动物转基因研究，频临灭绝动物品种保护及优良家畜品种扩增等方面。但至今体细胞克隆效率仍然不高，显著制约着此技术的广泛应用。

目前认为，克隆效率低下的主要原因是供体体细胞核没有被受体卵胞质完全的重编程，即重编程失败或不完全。此重编程过程中没有涉及基因序列的变化，主要是表观遗传修饰的变化。表观遗传修饰主要包括组蛋白乙酰化和DNA甲基化两方面。

TET3是一种DNA去甲基化酶，可以降低DNA甲基化的水平，但其酶活性在不同物种中发挥作用的时机并不相同，例如，研究表明，小鼠中敲除TET3基因，导致原核期胚胎中去甲基化作用部分丧失。

研究发现，山羊体细胞核移植胚胎甲基化水平异常偏高，降低供体细胞甲基化水平，是提高克隆胚胎发育质量及克隆效率的一种方法，但目前尚未发现一种有效降低体细胞甲基化水平的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体、细胞及方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体，包括用于共转染山羊供体细胞的阻遏蛋白表达载体和目的基因诱导表达载体；所述目的基因诱导表达载体包括目的基因以及通过与阻遏蛋白结合或分离调控目的基因表达的阻遏操纵基因，所述目的基因包括山羊TET3基因。

优选的，所述目的基因还包括与山羊TET3基因共表达的EGFP基因。

优选的，所述阻遏蛋白表达载体表达四环素阻遏蛋白TetR；所述目的基因诱导表达载体选自含有四环素操纵基因TetO的双向表达载体，且四环素操纵基因TetO对沿两个表达方向排列的目的基因同时进行调控，所述目的基因的序列包括位于其中一个表达方向上的EGFP基因读码框和位于另一个表达方向上的山羊TET3基因读码框。

优选的，所述双向表达载体还包括与EGFP基因及山羊TET3基因分别融合表达的Kozak序列。

优选的，所述双向表达载体还包括与山羊TET3基因以及对应Kozak序列融合表达的3×FLAG标签序列。

优选的，所述阻遏蛋白表达载体选自载体pEF1a-Tet3G；所述目的基因诱导表达载体选自重组载体pTRE3G-GTet3-EGFP-BI，该重组载体包括骨架载体pTRE3G-BI，并且在该载体的双向启动子两侧的多克隆位点分别插入有EGFP基因和山羊TET3基因，EGFP基因和山羊TET3基因的上游均设置有位于对应多克隆位点内的Kozak序列，山羊TET3基因与其对应的Kozak序列之间设置有3×FLAG标签序列。

优选的，所述重组载体pTRE3G-GTet3-EGFP-BI与载体pEF1a-Tet3G以2～4:1的质量比共转染山羊供体细胞。

优选的，所述山羊TET3基因(CDS)的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。