[发明专利]一种鹿血鉴定方法和鹿血鉴定试剂盒

说明书

本发明公开了一种鹿血鉴定方法，包括步骤：提取待测血液的基因组DNA；使用检测引物对基因组DNA中的cytb片段进行PCR扩增；使用第一限制性内切酶对PCR扩增片段进行酶切，判断待测血液为鹿血真品、鹿血伪品或鹿血真伪混合品；若待测血液判断为鹿血真品，使用第二限制性内切酶对PCR扩增片段进行酶切，判断鹿血为梅花鹿血或马鹿血。上述的检测方法能够同时完成对鹿血真伪、鹿血掺伪，以及梅花鹿和马鹿血液的鉴定，具有检测准确度高、可重复性好、操作简单和成本低的优势。本发明还公开了一种鹿血鉴定试剂盒，包括上述检测引物和限制性内切酶，能够实现对鹿血、非鹿血、梅花鹿血和马鹿血的快速、准确区分，适于大规模的生产和推广。

技术领域

本发明属于分子鉴定技术领域，具体涉及一种鹿血鉴定方法和鹿血鉴定试剂盒。

背景技术

鹿血是鹿科动物梅花鹿(Cervus nippon)或马鹿(Cervus elaphus)的血液，是传统名贵中药，其功效在历代医学典籍中均有记载，民间也广为流传。鹿血在我国作为药材已有很长的历史，唐代孙思邈的《千金翼方·食治》最早记录了鹿血的药用功效，之后历代本草中也均有记载，至明代，李时珍将鹿血的功效更详细的记录于《本草纲目》中：“主阳萎、补虚，止腰痛，鼻衄，跌伤，狂犬伤，和酒服治肺痿吐血，及崩中带下，诸气痛欲危者饮之立愈。大补虚损，益精血，解痘毒、药毒”。近代临床研究表明，鹿血可治心悸、失眠、健忘、跌伤、抗衰老等，在中医临床上亦有重要地位。随着人们对保健食品和药品的重视，使得鹿血的药用保健价值更为国内外关注，鹿血产品系列不断丰富，包括鹿血酒、鲜鹿血、鹿血晶等，所产生的市场价值和需求十分巨大。在经济利益的驱使下，市场上常会出现利用其它常见动物血液假冒的鹿血，或在鹿血产品中掺入其他常见动物血以次充好来降低成本，常用的动物血液为猪、牛、羊、鸭等的血液。常见动物血液与鹿血在外观以及理化性质上具有高度相似性，使性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定等传统中药鉴定方法在血液的鉴定中有一定的局限性。因此，目前迫切需要一种快速、准确的鹿血鉴定方法，以确保鹿血的真实度和纯度，从源头上控制鹿血品质。

分子鉴定具有反应快速、灵敏度高且特异性好等优点，是对传统鉴定方法的有效补充，在很多动植物鉴定中得到了成功应用。中国专利文献CN104745707A公开了一种利用PCR技术对兔、鸡、鸭、鹅、牛、羊、驴、马、猪和鹿的血液进行分子鉴定的方法，通过分析兔、鸡、鸭、鹅、牛、羊、驴、马、猪和鹿十种动物线粒体DNA中的遗传不保守区域基因(包括12SrRNA、16S rRNA、Cytb和D-Loop)，进行序列比对后，根据各序列上的特异碱基位点分别设计了各物种的特异性PCR引物对，其仅对相应的物种总DNA模板有扩增信号，对其他物种没有目的扩增信号，因此通过利用上述引物对不同动物血液进行PCR扩增，实现对不同物种的血液的定性检测。上述物种鉴定的方法能够区分兔、鸡、鸭、鹅、牛、羊、驴、马、猪和鹿的血液，但对鹿血是否掺伪进行鉴定时，需要分别使用十对不同物种的引物与血液样品的DNA模板进行PCR扩增反应，并对所得扩增片段进行序列测定，其检测过程复杂，检测周期长，检测成本高，而且无法对所选10个物种之外的样本进行鉴定。另一方面，上述的鉴定方法仅能区分鹿血与其他物种的血液，不能用于对梅花鹿和马鹿血液的鉴定，无法满足多基源中药材制备为成药时选定单一基源的要求。

发明内容

为此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中鉴定鹿血真伪和鹿血中是否掺伪的检测过程复杂、检测成本高，以及无法有效区分梅花鹿血液和马鹿血液的缺陷。

本发明提供了一种鹿血鉴定方法，包括以下步骤：

(1)提取待测血液的基因组DNA；

(2)使用检测引物对基因组DNA中的cytb片段进行PCR扩增；

(3)使用第一限制性内切酶对PCR扩增片段进行酶切，根据酶切产物的大小判断待测血液为鹿血真品、鹿血伪品或鹿血真伪混合品；所述第一限制性内切酶的酶切位点为鹿血的cytb片段中区别于非鹿血的cytb片段的酶切位点；