[发明专利]评估人体外受精胚胎质量及差异代谢物的筛选方法

权利要求书

1.一种评估人体外受精胚胎质量及差异代谢物的筛选方法，检测样本为人体外受精胚胎囊胚期的胚胎培养液，对照样本为新鲜培养液；将收集的胚胎培养液依次进行预处理、衍生、气相色谱-质谱检测，实验数据采用软件进行统计分析；根据t检验结果筛选正常发育胚胎与发育阻滞胚胎的差异代谢产物，并根据一种或几种差异代谢物评估体外受精胚胎质量和发育潜能。

2.如权利要求1所述的筛选方法，所述的胚胎培养液预处理方法如下：采集50～100μL培养液，添加2～10倍体积甲醇提取剂(含有内标准品)，涡旋震荡60秒混匀，于14000rpm，4℃离心15～30min，收集上清液，转移到1.5ml离心管中，真空浓缩干燥6～10小时。

3.如权利要求2所述的筛选方法，胚胎培养液和甲醇提取剂体积比为1：2～1：6，最适比例为1：4，内标物质是正十三酸(tridecanoic acid)，终浓度5～10μg/ml。

4.如权利要求1或2所述的筛选方法，所述的胚胎培养液衍生方法如下：加入50～100μL含有20mg/ml吡啶的甲氧胺溶液，置于37℃水浴中肟化反应1～3h，以保护羰基；然后加入40～100μL MSTFA试剂，置于37℃水浴中硅烷化反应1～3h，以增加代谢物的挥发性；硅烷化反应完成后，离心取上清液用于后续的GC-MS分析。

5.如权利要求4所述的筛选方法，胚胎培养液、甲氧胺盐酸盐溶液、MSTFA试剂的体积比为1：1：0.4～1：1：2，最适比例为1：1：0.8。

6.如权利要求1所述的筛选方法，气相色谱-质谱检测的条件：QP 2010 GC-MS系统耦合AOC-20i自动进样器(Shimadzu,Japan)；DB-5MS熔融石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm,Agilent Technologies,USA)用于代谢物的色谱分离；进样量1μL，分流比1:10；进样口温度为300℃；氦气(99.9995％，China)作为载气，流速40cm/s，恒线速模式；程序升温条件为：柱温在70℃保持3min，以5℃/min升至300℃，保持10min；质谱调谐采用全氟三丁胺(PFTBA)，离子化采用70eV的电子轰击电离源(EI)；检测电压依据调谐结果设置；传输线和离子源温度分别为280℃和230℃；溶剂切割时间5.0min，MS采集范围33-600m/z，采集频率4scans/s。

7.如权利要求1所述的筛选方法，实验数据采用SIMCA-P 11.5、Mev 4.9和SPSS18.0等软件中的一种或二种以上进行统计分析，根据t检验结果确定差异代谢物。

8.评估人体外受精胚胎质量的差异代谢物，正常发育胚胎与发育阻滞胚胎培养液中葡萄糖、氨基酸和脂肪酸含量差异较大，尤其是天冬氨酸、缬氨酸、亮氨酸、谷氨酸和丝氨酸等含量存在显著差异，可用作评估胚胎发育潜能的代谢指标。

9.评估人体外受精胚胎质量的差异代谢物，胚胎在发育过程中新合成的代谢物，包括柠檬酸、乳酸、棕榈酸和尿素中的一种或二种以上，可用来评估胚胎代谢能力和发育潜能的指标。

10.评估人体外受精胚胎质量的方法，胚胎在发育过程中新合成的代谢物，发育不良的囊胚培养液中柠檬酸、乳酸和棕榈酸中的一种或二种以上的增量低于3～5％，而发育良好的囊胚柠檬酸、乳酸和棕榈酸中的一种或二种以上的含量可以超过8％；通过定量检测新物质的含量和相对比值，可以评估胚胎的代谢能力和发育潜能。