[发明专利]用于检测基因突变的引物对组合、试剂盒以及构建文库的方法

说明书

本发明涉及用于检测基因突变的引物对组合、试剂盒以及构建文库的方法。所述试剂盒可与二代测序仪和数据分析一体机配合使用，用于检测人类33个基因的89个热点区域的突变。所述构建文库的方法包括：将本发明的引物对组合与DNA模板结合后，用高保真DNA聚合酶以脱氧核苷酸为底物，对待检基因特定区域进行体外扩增，并对扩增产物添加特定的核苷酸序列，从而获得DNA文库。

技术领域

本发明涉及核酸测序技术领域，特别涉及用于检测基因突变的引物对组合及试剂盒，以及构建二代测序DNA文库的方法。

背景技术

据世卫组织估计，2005年至2015年期间有8400万人死于癌症，超过70％的癌症死亡发生在低收入和中等收入国家。预计2030年形势将进一步恶化，估计将有1200万人死于癌症，按此趋势，发展中国家的癌症病例将增加81％，每年用于癌症的费用将达到4580亿美元。癌症是全世界首要的死因之一，在中国近年来随着环境污染，癌症发病率近年来呈逐年上升趋势，据全国肿瘤登记中心2011年监测的统计分析，当年新增癌症病例337万，相当于每分钟就有6.4人得癌，因此加强对癌症的防治迫在眉睫。

癌症的主要治疗手段还集中在以手术、化疗、放疗为主的传统治疗，以及近来的免疫疗法和靶向治疗。近年来，伴随癌症驱动基因EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA等与多种靶向药物小分子之间的关系被发现后，肿瘤治疗的新药越来越多，尤其是分子靶向药物，催生着肿瘤治疗已经步入基因时代。美国奥巴马总统提出“精准医疗”计划，中国也高度重视并相应地提出计划。

随着基因测序时代的来临，二代测序技术(Next-Generation Sequencing，NGS)以它高通量测序以及精准快速的分析结果赢来广泛的临床应用。然而，上市产品中多以单基因检测试剂盒为主，检测基因套餐则需多种试剂盒才能完成，而针对多基因进行检测的二代高通量测序技术因其单次测序可同时分析几十至数百个基因信息，从而使得对患者肿瘤基因进行更为细致全貌的分析成为可能。单次检测可在2天内完成，提取微量DNA即可，效率高，有效节约成本，适合临床大规模应用。

此外，目前的NGS数据分析系统涉及大量的人工操作，造成时间周期长、成本高、假阳性率高。因此，有必要开发一种尽可能减少人工操作、缩短检测时间、提高检测数据一致性的全自动数据分析系统。

发明内容

为了提高突变检测的特异性及准确性，并且提高检测效率，本发明针对人类33个基因的89个热点区域(表1)的突变，设计了一套引物对组合。

表1.人类33个基因的89个热点区域

所述引物对组合如下：

NRAS_4引物：SEQ ID No：1～2；

NRAS_3引物：SEQ ID No：3～4：

NRAS_2引物：SEQ ID No：5～6；

DDR2_18引物：SEQ ID No：7～8；

RET_10引物：SEQ ID No：9～10；

RET_11引物：SEQ ID No：11～12；

RET_13引物：SEQ ID No：13～14；

RET_15引物：SEQ ID No：15～16；

RET_16引物：SEQ ID No：17～18；

PTEN_1引物：SEQ ID No：19～20；

PTEN_5引物：SEQ ID No：21～22；

PTEN_6引物：SEQ ID No：23～24；