[发明专利]一种桔梗种子超低温保存方法

权利要求书

1.一种桔梗种子超低温保存方法，包括步骤以下：

(1)室温下将桔梗种子用A试剂处理，处理20～60min后，取出处理过的桔梗种子；

(2)处理过的桔梗种子放入装有B试剂的冻存管中，室温温育10～30min，再将其放入梯度降温盒中；

(3)将带有桔梗种子的梯度降温盒放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在‐35℃～‐55℃，降温速度为‐1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)所述A试剂是指B5液体培养液，还包含有1.5～2.5mol/L甘油和1～1.5mol/L二甲基亚砜。

3.根据权利要求1的方法，其中所述A试剂优选110～121℃高压蒸汽灭菌15min以上，冷却至室温放置。

4.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)所述梯度降温盒中含有100％异丙醇或甘油，可以重复使用。

5.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)所述B试剂是指B5液体培养液，还包含有2.8～3.8mol/L甘油、1.6～2mol/L二甲基亚砜和0.45～0.6mol/L蔗糖。

6.根据权利要求1的方法，其中所述B试剂优选110～121℃高压蒸汽灭菌15min以上，冷却至室温放置。

7.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)所述低温冰箱的温度要求一般在‐70℃以下。

8.根据权利要求1的方法，其中所述保存的桔梗种子进行解冻时，若室温超过20℃，将冻存管从液氮中取出，直接利用室温自然解冻；若室温低于20℃，将冻存管从液氮中取出，并置于20～24℃水浴箱中解冻。解冻完后，取出冻存管中桔梗种子，用丙酮浸泡10～30min，再用自来水或者蒸馏水洗涤3～5次，清洗后桔梗种子直接用于培养。