[发明专利]一种基于热击的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法

权利要求书

1.一种基于热击的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法，其特征是包括以下步骤：将培养至对数早期的哈维弧菌受体菌热击处理后与培养至对数早期的供体菌进行等体积混匀，室温离心去上清，菌沉淀后重悬，点种至固体平板上，接合过夜，通过对接合受体菌哈维弧菌热击处理，使得哈维弧菌的接合转化效率从无到有，从而对哈维弧菌进行基因敲除；

热击处理时的温度为38℃；

热击处理时的时间为30min；

28℃接合过夜；

所述供体菌为pSW7848-△rbsB-E .coli GEB883，其构建方法如下；

(1)确定待突变基因rbsB的上下游序列以及自杀质粒pSW7848的插入位点，利用NEB在线软件设计无缝克隆法重组子载体构建引物，得到上游同源臂扩增引物对rbsB-UP-F/R、下游同源臂扩增引物对rbsB-DOWN-F/R，自杀质粒线性化引物对pSW7848-F/R，重组子质粒检测引物对pSW7848-check-F/R及待突变基因缺失检测引物对rbsB-Del-check-F/R；

PCR引物序列如下：

rbsB-UP-F：aagcttgatatcgaattcgtcactgattgcactgttatttttg

rbsB-UP-R：tttacctgacgttctagtcctttgtgtaggg

rbsB-DOWN-F：ctagaacgtctggtaaagatgtactcatcgttggc

rbsB-DOWN-R：ttggtaacgaatcagacgccgcttcttgtgcgctg

pSW7848-F：gtctgattcgttaccaattatgacaac

pSW7848-R：gaattcgatatcaagcttatcgatac

pSW7848-check-F：tcactgtcccttattcgcacc

pSW7848-check-R：ctgcttttgagcactacccg

rbsB-Del-check-F：tgggtggtaaaggtcgcataa

rbsB-Del-check-R：tcgcctggacgagggaaag

(2)提取哈维弧菌基因组为模板，基于引物对rbsB-UP-F/R和rbsB-DOWN-F/R，利用PCR技术获取996bp的上游同源臂片段UP及1022bp下游同源臂片段DOWN，具体如SEQ ID NO .1所示，琼脂糖电泳检测后切胶回收，回收产物-20℃保存，备用；

PCR扩增体系如下：

2×PrimeSTAR Max Premix 25 .0μL，上游引物F 10μM 2 .0μL，下游引物R 10μM 2 .0μL，基因组模板 20ng/μL 2 .0μL，用ddH2O补足50μL；

PCR扩增程序如下：

98℃预变性30sec；98℃变性10sec，55℃5sec，72℃5sec，35个循环；72℃延伸7min；

(3)提取自杀质粒为模板，基于引物对pSW7848-F/R，利用PCR技术获取长度为3309bp的质粒线性化片段，琼脂糖电泳检测后切胶回收，回收产物-20℃保存，备用；

PCR扩增体系如下：

2×PrimeSTAR Max Premix 25 .0μL，上游引物F 10μM 2 .0μL，下游引物R 10μM 2 .0μL，质粒模板 1ng/μL 2 .0μL，用ddH2O补足50μL；

PCR扩增程序如下：

98℃预变性30sec；98℃变性10sec，53℃15sec，72℃17sec，35个循环；72℃延伸7min；

(4)利用商品化多片段无缝克隆试剂盒将步骤(2)获得的上下游同源臂与步骤(3)获得的质粒片段进行等温组装；

(5)将等温组装液转化入大肠杆菌Escherichia coli GEB802感受态细胞，基于引物对pSW7848-check-F/R，利用PCR检测后获得阳性重组子pSW7848-△rbsB,如SEQ ID NO .2所示，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，长度为2216bp；

PCR扩增体系如下：

2×Premix TaqTM 25 .0μL，上游引物F 10μM 2 .0μL，下游引物R 10μM 2 .0μL，菌液模板2 .0μL，用ddH2O补足50μL；

PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃30sec，72℃2 .5min，35个循环；72℃延伸10min；

(6)提取阳性重组质粒pSW7848-△rbsB转化入大肠杆菌E .coli GEB883感受态细胞，得到携带了重组子的pSW7848-△rbsB-E .coli GEB883，并以其作为接合供体菌。