[发明专利]一种禾谷镰胞菌脂肪酶突变体及其编码基因和工程菌

说明书

本发明公开了一种禾谷镰胞菌脂肪酶突变体及其编码基因和工程菌，其氨基酸序列为SEQ ID No:2；脂肪酶突变体的基因序列为SEQ ID No:4；将所述基因克隆到表达载体上，然后进行细胞转化，获得重组基因工程菌。以橄榄油乳化法测定突变体的酶活及最适反应温度，突变体的酶活力较野生型提高了2倍以上，同时最适反应温度由原来的40℃提高到55℃。

技术领域

本发明属于酶的基因工程技术领域,具体地说涉及利用分子生物学技术获得酶活力及最适温度提高的禾谷镰胞菌脂肪酶突变体。

背景技术

脂肪酶(EC3.1.1.3)不仅可催化油脂水解,也能催化酯合成、转酯等反应,被广泛地应用于洗涤剂、添加剂、食品、制药、造纸和生物能源等领域。脂肪酶现已成为市场上的第三大工业用酶。从二十世纪开始,美国等国家就开展了对脂肪酶的研究，并不断推出市场化产品。然而，国内对脂肪酶的研究起步较晚，在脂肪酶开发、发酵菌种、酶学性质、酶活性以及应用效果等方面与国外的先进技术有很大的差距，不仅不利于新型酶蛋白的开发，更影响了其下游的产业化应用及市场化发展。因此，急需开发新的酶学性质优良的脂肪酶，提高应用效果，并降低生产成本，从而促进脂肪酶的广泛应用。

酶学特性是影响脂肪酶应用的关键因素，其中以酶活力尤为重要。筛选获得更高活力的脂肪酶突变体一直是本领域的研究热点。目前，寻找和开发酶学性质优良的脂肪酶主要途径有两个:一是筛选产新型酶的微生物；二是通过定向进化的方法对现有酶蛋白进行适当的蛋白质工程改造。这两种方法其共同的缺点是工作量大、周期长、随机性强，往往很难筛选到理想菌株。

蛋白质理性设计是近年来新兴起的改变酶自身性质的有利工具，它建立在人们对酶结构一功能关系和催化机理的了解上，对选定的位点进行突变，从而优化酶分子的各种性质。随着结构生物学、分子动力学模拟等领域的发展，基于理性设计的蛋白质工程改造已经在酯酶和脂肪酶性质改造领域取得的成功，主要集中于提高酶的催化反应活性，改进底物特异性，提高热稳定性，对映立体选择性等方面(Trends Biotechnol,2002,20(10):433-437)。

发明人在前期研究中成功构建了禾谷镰胞菌(Fusarium graminearum)脂肪酶GZEL的大肠杆菌重组表达菌株及酶蛋白的制备方法(Int.J.Mol.Sci.2017,18(7):1535；中国发明专利201710375132.6)，酶学性质测定结果表明该酶具有广泛的底物选择性，可应用于多种工业领域，但该酶的活力和反应温度参数仍不是很理想。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供酶活力及最适温度提高的禾谷镰胞菌脂肪酶突变体。本发明以禾谷镰胞菌脂肪酶基因为模板,利用蛋白质理性设计技术设计突变体，改造获得了酶活力及最适温度同时提高的脂肪酶突变体,进一步提高了该酶的应用范围与催化效率。

本发明的技术方案如下：

本发明脂肪酶突变体由氨基酸序列为SEQ ID No.1(GenBank:EYB32950.1)的禾谷镰胞菌脂肪酶作为亲本，在此基础上，将284-334位点氨基酸(AGGISWRRYRSAKRESISERATMTDAELEKKLNSYVEMDKEYIKTHASRSS)删除，同时，将277-283位点的氨基酸由原来的QATDACS替换为GLIGTCL，以最终得到突变体，其氨基酸序列为SEQID No:2。

编码上述脂肪酶突变体的基因，其核酸序列为SEQID No:4。

一种重组基因工程菌，将上述基因克隆到表达载体上，然后进行细胞转化，获得重组基因工程菌。

优选地，所述表达载体为pFL-B62cl、pFL-B13cl、pSUMO、pMAL、pGEX、pPIC9K、pPICZα、pPIC3.5K、pPICZ或pYDI。

优选地，所述细胞为大肠杆菌、毕赤巴斯德酵母或酿酒酵母的感受态细胞。