[发明专利]一种食源性化脓链球菌LAMP引物组及试剂盒与应用

说明书

本发明涉及食品安全的分子生物学检测技术领域，公开了一种食源性化脓链球菌LAMP引物组及试剂盒与应用。所述LAMP引物组包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，以化脓性链球菌转录调控基因spy1258作为靶基因，用于定性检测食品及食品接触材料中的化脓链球菌。所述试剂盒包括所述食源性化脓链球菌的LAMP引物组、DNA聚合酶、2×反应缓冲液、密封液、荧光染料、阳性对照、阴性对照。本发明试剂盒可对1fg/μL的化脓链球菌有效检出，具有非常高的灵敏度。引物组对靶序列6个位点进行特异性扩增，保证了其特异性且与其它菌株无交叉反应。整个扩增过程只需1h即能完成，目的基因产量最高可达10¹⁰拷贝。

技术领域

本发明涉及食品安全的分子生物学检测技术领域，更具体的，涉及一种食源性化脓链球菌LAMP引物组及试剂盒与应用。

背景技术

链球菌属通常分为化脓和非化脓两类，化脓性链球菌出现β-溶血，非化脓性链球菌出现α-溶血或不溶血。常见的化脓性链球菌有化脓链球菌、无乳链球菌等。非化脓性链球菌有缓症链球菌群包括口腔链球菌、肺炎链球菌等。

化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes，S.pyogenes)又称酿脓链球菌，是一种革兰氏阳性菌，属于厚壁菌门、链球菌属。S.pyogenes形态有圆形的，也有卵圆形的，一般呈链状排列，无芽孢，有荚膜。研究发现S.pyogenes有多种分型，它们导致S.pyogenes的菌落形态各异，一般分为三大类：(1)粘液样菌落。这类菌落外形较大，表面凸起，含水分较多；(2)无光泽菌落。这类菌落表面扁平，比较粗糙，透明度较高；(3)有光泽菌落。这类菌落外形较小，表面比较平滑有光泽(Johnson DR and Kaplan EL 1996)。

食源性致病菌是导致食品安全问题的重要来源。食品致病菌是可以引起食物中毒或以食品为传播媒介的致病性细菌。致病性细菌直接或间接污染食品及水源，人经口感染可导致肠道传染病的发生及食物中毒以及畜禽传染病的流行。近年来，由化脓链球菌引发的细菌性感染呈增长趋势，严重危害人们安全和健康。

不同来源的化脓性链球菌具有不同属性。不同于痰液、脑脊液及其他分泌物等样品中化脓性链球菌，本发明的化脓性链球菌是一种常见的食源性致病菌，为革兰氏阳性链球菌，其形态为圆形或卵圆形，一般呈链状排列，能够β型溶血现象。食品中常见于奶、肉、蛋及其制品中，化脓链球菌能够引起皮肤软组织感染、脓疱疮、急性咽炎等疾病。

目前我国对化脓链球菌的检测方法包括传统的微生物培养鉴定、免疫检测和PCR检测技术等。传统培养法存在操作繁琐、耗时长及灵敏度低等缺点；免疫检测法虽然灵敏度较高且耗时较短，但特异性较低；近年发展起来的PCR法在时耗、特异性及灵敏度均能很好符合要求，但其对设备要求高而难以在基层及现场检测普及。

环介导等温扩增((loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种近年来发展起来的新型基因扩增技术，其利用4条特异性引物(内、外引物各两条)和Bst DNA聚合酶，特异性识别靶序列上的6个独立位点，在恒温条件(65℃左右)下可以特异性、高效、快速的扩增DNA靶序列，其能在1h内扩增靶基因至10⁹～10¹⁰拷贝。LAMP技术具有操作简单、反应速度快、灵敏度高、特异性好及价格廉价等优点，目前已经在致病菌检测、转基因成份检测、疾病诊断等领域广泛应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服上述缺陷，提供一种食源性化脓链球菌LAMP引物组。

本发明的另一目的在于提供一种具有食源性化脓链球菌LAMP引物组的试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种食源性化脓链球菌LAMP引物组及其试剂盒的应用。

本发明通过以下技术方案实现：