[发明专利]一种RNA病毒基因组的定点改造方法

说明书

本发明涉及生物科技技术领域，尤其是一种RNA病毒基因组的定点改造方法，包括以下步骤：S1、构建定点切割的核酸酶系统：构建至少一个包含导向功能的分子和具有定点切割RNA活性的蛋白核酸酶系统；S2、构建包含有特异性突变、缺失或插入序列的同源序列；S3、构建病变细胞；S4、转染细胞；S5、收集子代病毒收获液；S6、分离出子代病毒。本发明能够高效的实现RNA病毒基因组的定点改造,并能够快速方便地筛选获得具有特定突变类型的重组病毒。

技术领域

本发明涉及生物科技技术领域，尤其涉及一种RNA病毒基因组的定点改造方法。

背景技术

RNA病毒是的遗传物质是由核糖核酸组成(RNAribonucleicacid)，通常核酸是单链的(ssRNAsingle-strandedRNA),也有双链的(dsRNAdouble-strandedRNA).单链的RNA病毒根据他们的翻译意义可分为正译、负译和双向翻译的RNA病毒，正译的RNA病毒与mRNA相似，可以直接被宿主细胞翻译成蛋白质；负译RNA病毒则需要借助RNA酶的作用，以自身为模板编译出与原病毒相反义的RNA，之后再以此RNA来翻译成蛋白质。

目前对于DNA病毒基因组的定点突变，主要有两种方法，一种方法是借助于限制性内切酶等工具酶对病毒基因组进行细胞外的基因重组操作，但对于较大的病毒基因组，很难找到可以使用的单个限制性酶切位点。另一种方法是借助于细胞内的同源重组系统，通过向病毒感染细胞中转染与病毒基因组相似的同源序列，完成对特定区域基因组序列的定点编辑，由于这种同源重组效率极低，因此并不适合高通量的病毒疫苗株筛选，为了克服这种困难，往往需要向病毒导入外源性抗性基因用于重组病毒的筛选，这种操作不但费时费力，而且在生物安全性上并不适合疫苗株的要求。如何简单、高效、精确地对大型DNA病毒基因组进行定点编辑，仍是疫苗开发中的一个技术瓶颈。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种RNA病毒基因组的定点改造方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

设计一种RNA病毒基因组的定点改造方法，包括以下步骤：

S1、构建定点切割的核酸酶系统：构建至少一个包含导向功能的分子和具有定点切割RNA活性的蛋白核酸酶系统；

S2、构建包含有特异性突变、缺失或插入序列的同源序列；

S3、构建病变细胞：

A1、细胞的培养：选取水解酪蛋白琼脂灭菌处理后，水解酪蛋白琼脂是由重量百分比为5-25％牛肉浸汁粉，40-60％水解酪蛋白，2-16％的淀粉，15-36％的琼脂混合后加入蒸馏水水解而成，与人红细胞液按体积比为8-22∶1混合均匀，得到细胞培养液；

A2、在盛放有细胞培养液的培养板中加入病毒液，吸附，然后吸去病毒液，培育至细胞完全病变，得到病变细胞；

S4、转染细胞：收集上一步的病变细胞，使用S1和S2得到核酸酶系统和同源序列共同转染细胞，得到转染细胞，其中，控制细胞数量与表达核酸酶系统的质量之间的比例为1×105:0.5-3μg；

S5、收集上一步得到的病变细胞和/或上清，冻融或超声处理后，离心去除细胞碎片，所得上清即为子代病毒收获液；

S6、从上一步得到的子代病毒收获液中，挑取来源于单克隆的子代病毒，通过核酸测序鉴定，分离出子代病毒；完成RNA病毒基因组的定点改造。

优选的，插入序列的个数为两个。

优选的，S4中转染12-36h后得到转染细胞。

优选的，S3中细胞的培育时间为15-20h。