[发明专利]一种紫花苜蓿-玉米/小麦轮作对土壤影响的试验方法

权利要求书

1.一种紫花苜蓿-玉米/小麦轮作对土壤影响的试验方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、选取5龄紫花苜蓿地进行草田轮作试验；轮作区第一年3月进行翻耕，对照区CK不翻耕；试验采用完全随机区组设计，轮作区设3次重复，各重复区面积均为4 m×5 m；第一年和2第二年年4月15日播种玉米和小麦，播种前施磷二胺225 kg·hm-2和尿素225 kg·hm-2作为基肥，轮作区施基肥与翻耕区相同，每年入冬之前灌1次冬水；

步骤2、土样采集

于第一年3月份取5 龄紫花苜蓿地土样，第二年、第三年小麦收获季7月下旬、玉米收获季9月下旬，分别取紫花苜蓿轮作玉米、小麦田的土样，各轮作处理按照“5点取样法”，用土钻分别取0～30 cm土层土样，将所得土样装入塑料袋，内外附上标签，写明采样地点、采样日期和采样深度；除去枯枝落叶，挑出植物细根，均匀混合后，过1 mm筛，均分为3份，一份带回实验室立即测定土壤苜蓿自毒物质含量，一份用于测定分析土壤养分，一份保存-4℃，用于测定土壤微生物种群数量；

步骤3、土壤养分含量测定

土壤有机质含量采用重铬酸钾法测定；土壤全氮采用凯氏定氮法测定；土壤碱解氮采用碱解扩散法；全钾采用火焰光度法；土壤有效钾含量先用醋酸铵浸提，再用火焰光度法测定；全磷采用HCLO4-H2SO4消煮法；有效磷碳酸氢钠浸提-铝锑抗比色法测定；

步骤4、土壤微生物种群数量测定

土壤微生物采用平板表面涂抹法：细菌用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，真菌用马丁－孟加拉红培养基培养基，放线菌用改良高氏一号培养基，将涂好平板的培养皿放入28 ℃的培养箱中培养，细菌培养2～3 d，真菌培养5～7 d，放线菌培养7～10 d，3次重复；

步骤5、土壤中酚酸类自毒物质测定

准确称取各处理20 g土样，用甲醇萃取定容至25 mL，立即用于HPLC分析；运用HPLC技术对土壤中各酚酸和香豆素含量进行定性定量分析，带检测的酚酸包括绿原酸、阿魏酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸，香豆素；

步骤6、数据统计

采用Excel 2013进行数据处理和作图；用SPSS 24.0进行单因素方差分析。

2.根据权利要求1所述的紫花苜蓿-玉米/小麦轮作对土壤影响的试验方法，其特征在于，步骤5中，分析条件如下：高效液相色谱仪 Agilent 1100 ，色谱柱 C18，PN 959990-902，5 µm，4.6*250 mm ，流动相A：甲醇。