[发明专利]产生IPS细胞的方法

说明书

本申请是申请号200980138340.8的专利申请的分案申请。

发明背景

本申请要求2008年8月12日提交的美国申请号61/088,054的优先权，该申请的全部内容无所放弃地通过引用方式特别并入本文。

1.发明领域

本申请大体上涉及干细胞领域。更具体而言，本申请涉及体细胞的重编程(reprogramming)。

2.相关技术描述

一般而言，干细胞是未分化的细胞，其可以产生成熟的功能性细胞的演替。例如，造血干细胞可以产生任意的不同类型的末端分化的血液细胞。胚胎干(ES)细胞源自胚胎，其是多潜能的，因此具有发育成任意器官或组织类型，或至少潜在地发育成完整胚胎的能力。

诱导的多潜能干细胞(induced pluripotent stem cell)，通常简称为iPS细胞或iPSC，是一类通过插入某些基因人工地从非多潜能细胞(通常为成年体细胞)衍生而来的多潜能干细胞。人们相信，在很多方面，诱导的多潜能干细胞与天然多潜能干细胞例如胚胎干细胞是相同的，例如在以下方面：某些干细胞基因和蛋白的表达、染色质甲基化的式样、加倍时间、胚状体(embryoid body)的形成、畸胎瘤的形成、活嵌合体的形成以及潜能和分化能力，但是其与天然多潜能干细胞的相关性的完整程度仍待确定。

IPS细胞首先于2006年从小鼠细胞中产生(Takahashi等人,2006)，于2007年从人类细胞中产生(Takahashi等人,2007；Yu等人,2007)。这在干细胞研究中被认为是重要的进展，因为这可以允许研究人员获得多潜能干细胞而不必争议性地使用胚胎，多潜能干细胞在研究中具有重要意义并且具有潜在的治疗性应用。

但是，在这些诱导的多潜能干(iPS)细胞的研究的现阶段，产生iPS细胞的效率低下，这阻碍了iPS细胞在临床研究中的应用。因此，需要开发一种增强产生诱导的多潜能干细胞的效率的方法。

发明概述

本发明通过以改善的效率提供诱导的多潜能干细胞而克服了本领域中的主要缺陷。在第一个实施方式中，提供了用于产生诱导的多潜能干(iPS)细胞群体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)获得一个或多个重编程载体，每个载体包含表达盒，所述表达盒包含：(i)转录调节元件；(ii)与所述转录调节元件可操作地连接的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列编码重编程因子或报告分子；(iii)位于所述第一核苷酸序列的3’端的IRES；和(iv)编码重编程因子或报告分子的第二核苷酸序列，其位于所述IRES的3’端，从而所述第二核苷酸序列受到所述IRES的翻译控制，其中：(1)，如果所述第一核酸编码重编程因子，则所述第二核苷酸序列编码另一重编程因子或报告分子；和(2)如果所述第一核酸编码报告分子，则所述第二核苷酸序列编码重编程因子；(b)将所述重编程载体导入体细胞群体的细胞中；(c)培养所述细胞以扩展所述群体；(d)选择所述经扩展的群体的子代细胞，其中所述子代具有胚胎干细胞的一个或多个特征；和(e)培养所选择的子代细胞以提供iPS细胞群体。

在一些方面，所述第一核苷酸序列编码重编程因子并且所述第二核苷酸序列编码报告分子，反之亦可，因此报告基因的同时表达辅助如下文描述的重编程细胞的选择。

为了在同一转录调节元件下共表达多个重编程因子，表达盒可以包含第二IRES和位于第二IRES的3’端的第三核苷酸序列，从而所述第三核苷酸序列受到所述第二IRES的翻译控制。在一些实施方式中，所述第一和第二核苷酸序列可以编码不同的重编程因子。在以上任意情况下，报告分子可由第一、第二或第三核苷酸序列编码以改善转染和iPS细胞选择效率。

本发明的能力部分依赖于报告分子的表达，例如荧光蛋白，其作为感染效率的指示，一般与来自同一多顺反子转录本的重编程基因的表达水平相关联，一旦细胞被完全诱导为多潜能，则所述报告分子即沉默。例如，上述方法的步骤c)可以进一步包括选择体细胞的群体，其中所述体细胞表达报告分子，并且培养所选细胞以扩展该群体。因此，在一些方面，可以使用荧光辅助的细胞分选法(FACs)基于报告分子例如荧光蛋白的表达水平来选择被感染(从最低效率感染至最高效率感染)的细胞。