[发明专利]一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因及其应用

说明书

本发明公开了一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因，包括糙皮侧耳gpd启动子，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示,所述糙皮侧耳锰过氧化物酶基因包括mnp6和vp3基因，其DNA序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示，mnp6的蛋白质氨基酸序列如Seq ID NO：3所示，vp3的蛋白质氨基酸序列如Seq ID NO：5所示。本发明将成功转化的过表达菌株接种到棉花固体培养基上培养30d，测定木质素含量，结果发现Pomnp6和Povp3过表达菌株的木质素降解率较未转化菌株分别提高了8.62％和7.46％。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因，包括两 种锰过氧化物酶基因mnp6和vp3在糙皮侧耳中的过表达、检测及其在木质素降解中的应用。

背景技术

作物秸秆中的主要成分有木质素、纤维素和半纤维素等，其中木质素和半纤维素以 共价键形式相结合，使纤维素分子包埋在其中，导致秸秆资源难以被充分利用。利用真菌分泌的胞外氧化酶来降解木质素,不但条件温和、无二次污染，可实现秸秆再利用， 而且还可以获得一定经济效益。

现已知白腐真菌分泌的木质素降解酶主要有木质素过氧化物酶(ligninperoxidase， LiP)，锰过氧化物酶(manganese-dependent peroxidase，MnP)，漆酶(laccase，Lac)和多功 能过氧化物酶(versatile peroxidase，VP)。

其中，锰过氧化物酶(MnP，EC1.11.1.13)是一种含有血红素的酶蛋白，在含有H₂O₂和Mn^2﹢的催化条件下，MnP能将芳香环类化合物氧化，在木质素降解过程中起着至关 重要的作用。此外，VPs是一类特殊的锰过氧化物酶，它能够同时具有LiP和MnP的 活性。近年来，随着研究的深入，发现VP既能够氧化Mn²⁺，又能够氧化VA、CIP等， 由于它的催化具有多功能性，因此在研究木质素生物降解过程中同样具有极其重要的意 义。

糙皮侧耳是一类重要的食用菌，在全球食用菌市场占第二大重要位置，在中国也是 一种很受欢迎的食用菌。它不仅可以作为菌类被食用，还可以降解木质素，对生物质利用具有重要作用。但糙皮侧耳本身降解木质素能力较弱，且降解机制尚未阐明。因此， 研究木质素降解酶系对指导实际生产和木质素降解具有极其重要的作用。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因及其 获取方法，质粒载体的构建方法，检测重组表达质粒是否插入糙皮侧耳野生型菌株的方法，将成功转化的过表达菌株接种到棉花固体培养基上培养30d，测定木质素含量，结 果发现Pomnp6和Povp3过表达菌株的木质素降解率较野生型分别提高了8.62％和7.46％。

一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因，包括糙皮侧耳gpd启动子，其DNA序列如SEQ IDNO:1所示,所述糙皮侧耳锰过氧化物酶基因包括mnp6和vp3，其DNA序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示，mnp6的蛋白质氨基酸序列如Seq ID NO：3所示，vp3的蛋 白质氨基酸序列如Seq ID NO：5所示。

一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因的获取方法，包括以下步骤：

1)cDNA反转录，糙皮侧耳菌丝接种到PDA培养基上培养7d扩繁后，将菌丝取 出，利用RNA提取试剂盒提取总RNA，采用荧光反转录试剂盒反转录成cDNA；

2)引物设计，引物设计采用Primer Premier 5.0完成，设计的引物包括gpd-F、gpd-R、 mnp6-F、mnp6-R、vp3-F、vp3-R，并进行引物合成；