[发明专利]一种基于双分子荧光互补技术的CRP检测试剂盒、制备及使用方法

说明书

本发明提供了一种基于双分子荧光互补技术的CRP诊断试剂盒。所述试剂盒包括：抗CRP抗体偶联的荧光蛋白N端片段、抗CRP抗体偶联的荧光蛋白C端片段；本发明还公开了所述一种基于双分子荧光互补技术的CRP诊断试剂盒的制备方法，该方法包括：抗CRP抗体偶联的荧光蛋白N端片段的制备、抗CRP抗体偶联的荧光蛋白C端片段的制备；最后还公开了该试剂盒的使用方法；本发明试剂盒具有操作简单、线性范围宽、特异性好、免清洗、准确度高等优点，便于临床检测使用，其应用于炎症和心脑血管疾病风险预测，能够更加准确地预测炎症和糖尿病合并心脑血管事件的危险发生率，具有极大的市场价值。

技术领域

本发明涉及一种双分子荧光互补技术用于体外免疫诊断检测人体内CRP的含量，属于疾病诊断检测领域。

背景技术

C-反应蛋白(CRP)是一种敏感的急性时相反应蛋白，是由Tillet和Francis在急性大叶性肺炎患者血清中发现一种物质，能在钙离子存在时与肺炎球菌C-多糖起沉淀反应，在人体遭受细菌感染或者组织损伤时，血清中C-反应蛋白浓度可快速升高。CRP值的升高滞后于炎症活动变化12小时左右。但重要的是比临床症状的变化发现要早，如类风湿关节炎中早4～ 6周。因此CRP值可为临床快速决定提供一种方法。CRP的临床参考值：≤10mg/L。在炎症开始数小时就升高，48小时即可达峰值，随着病变消退、组织、结构和功能的恢复降至正常水平，同时CRP水平的高低反映了患者应激反应的强弱。此反应不受放疗、化疗、皮质激素治疗的影响。

因此，CRP的检测在临床应用相当广泛，包括急性感染性疾病的诊断和鉴别诊断，手术后感染的监测；抗生素疗效的观察；病程检测及预后判断等。CRP升高的程度反应炎症组织的大小或活动性，在急性炎症和感染时，CRP与疾病活动性有良好的相关性，足以用来作为治疗监测。CRP值为10～50mg/L表示轻度炎症，例如局部细菌性感染(如膀胱炎、支气管炎、脓肿)、手术和意外创伤、心肌梗死、深静脉血栓、非活动性结缔组织病、许多恶性肿瘤和多数病毒感染。CRP值升为100mg/L左右表示较严重的疾病，它的炎症程度必要时需静脉注射。CRP值大于100mg/L，表示严重的疾病过程并常表示细菌感染的存在。

用乳胶免疫比浊法等敏感方法测出的较低浓度的血清CRP称为超敏CRP(hs-CRP)，超敏CRP与心血管事件相关。hs-CRP已是公认的预测未来心血管事件(急性冠状动脉综合征、心肌梗死、卒中等)发生危险性的有效指标。国际上通用的Reynold Score将hs-CRP纳入其中。hs-CRP对冠心病患者的临床危险分层有重要参考价值。急性冠状动脉综合征：hs-CRP及肌钙蛋白T/肌钙蛋白I、脑钠素是急性冠状动脉综合征的生物学标志物。动态监测hs-CRP有利于观察冠心病的严重程度和演变情况，及早预测可能发生的急性冠状动脉事件。研究显示，稳定性冠心病者置入冠状动脉支架6h后CRP即增加，48h达高峰，而后平稳下降。稳定性心绞痛患者在置入冠状动脉支架72h后测定CRP水平，并进行连续1年的随访，CRP＞5 mg/L较CRP＜5mg/L的患者存活率显著降低。支架置入后再狭窄可能与慢性炎症有关， hs-CRP水平有助于预测再狭窄。冠状动脉搭桥手术治疗的冠心病患者通常在术后6h内CRP 增高，无并发症时应在72h以后开始下降至正常。对于冠状动脉搭桥手术后hs-CRP持续增高者如能排除感染因素，也可作为评估冠状动脉搭桥术后危险的指标。

常用的CRP检测方法有酶联免疫吸附试验、及乳胶免疫比浊等。酶联免疫吸附试验法采用双抗夹心法，检测灵敏度较低，目前主要应用于传染性疾病筛查等对检测灵敏度要求较低的项目，并且反应时间较长。乳胶免疫比浊法是利用抗原抗体反应原理测定血清中CRP的含量。样品中CRP抗原的与包被的胶乳颗粒上的抗人CRP抗体形成免疫复合物，产生的浊度与样品中的CRP含量呈正比，用比浊法进行测定，从而求得样品中的CRP的含量，此方法无法兼顾灵敏度和线性，检测hs-CRP和普通CRP需要两套试剂盒完成。