[发明专利]一种多巯基修饰的共价偶联抗体的复合纳米粒子探针的制备方法

说明书

本发明涉及一种多巯基修饰的共价偶联抗体的复合纳米粒子探针的制备方法，在金纳米、氧化硅纳米、银纳米、磁性纳米或其两种复合纳米粒子表面修饰多巯基化合物，形成表面具有氨基、羧基、羟基等功能基团，再通过偶联剂与抗体共价结合，形成稳定的纳米探针，用于体外诊断试剂中目标待测物检测或疾病诊断。本发明制备的共价偶联抗体的多巯基修饰的纳米粒子探针具有性能稳定，与蛋白结合能力强，极大消除空间位阻影响等诸多优点，在免疫诊断，分子诊断等领域都有良好的应用前景。在生物医学各领域都具有非常好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种多巯基修饰的共价偶联抗体的复合纳米粒子探针的制备方法，属于体外诊断领域。

背景技术

磁性纳米粒子、贵金属纳米粒子均是新型的功能性材料。MNPs具有粒径小、比表面积大、易表面修饰、生物相容性、低毒性等特点，还具有特有的磁响应性，可在恒定磁场下聚集和定位。贵金属纳米粒子，常见的是金纳米粒子(gold nanoparticle)和银纳米粒子，具有独特的光学性质、易进行表面修饰、具有强的还原性、高的化学稳定性以及良好的生物相容性等特点。这些纳米粒子在生物分析和生物医药等领域被广泛应用，但是也存在一些自身局限，磁性纳米粒子的比表面积很大，其表面活性极高，容易发生团聚和氧化，贵金属纳米粒子标记蛋白后的复合物在免疫层析过程中是不稳定的，可能会有分离的现象出现，从而导致免疫诊断结果出现假阳性等错误的结果。

将不同的识别分子(如功能基团)修饰到这些纳米粒子上，获得功能化纳米粒子(纳米探针)，有助于拓宽其应用范围，发展基于这些纳米粒子的分析/检测方法。保持纳米粒子的单分散性和稳定性是在实际应用中的关键，通过添加新型稳定剂或通过各种修饰方法能够提高纳米粒子的分散性和稳定性。例如贵金属纳米粒子能够与巯基形成很强的化学键(如Au-S 键，Ag-S键)，可以通过共价偶联的方法将化合物修饰到纳米粒子表面，稳定纳米粒子，维持纳米粒子良好的分散性。

金纳米粒子、银纳米粒子、磁性纳米粒子与抗体、蛋白质为非共价键结合，应用于免疫层析的过程中容易脱离，造成结果的错误，对纳米粒子进行修饰处理时，选择带合适的功能团例如-NH₂，-COOH，-OH等的烷基硫醇物，既能够稳定纳米粒子又能使得与抗体蛋白的结合由非共价结合变为共价结合，结合更加牢固。例如硫辛酸小分子修饰的纳米粒子通过偶联钴化合物而特异性地连接组氨酸标记的蛋白质，这种作用方式可以减少蛋白质与金纳米粒子间的非特异性吸附，提高纳米粒子与蛋白质的利用效率。

针对磁性纳米粒子和贵金属纳米粒子存在的优缺点，考虑通过对纳米粒子的表面进行巯基功能化修饰，将单一的巯基修饰方式进化为混合的多巯基修饰方式，更大的幅度的提高纳米粒子稳定性和分散性，以及增强目标蛋白的选择性识别作用。

发明内容

针对现有纳米粒子在免疫标记过程中存在的问题，本发明提供一种多巯基修饰的共价偶联抗体的复合纳米粒子探针的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种多巯基修饰的共价偶联抗体的复合纳米粒子探针的制备方法包括以下步骤：

(1)制备金纳米、氧化硅纳米、银纳米、磁性纳米、两种或多种任意组合形成的复合纳米粒子；

(2)在金纳米、氧化硅纳米、银纳米、磁性纳米或其两种复合纳米粒子表面修饰多巯基化合物，表面形成氨基、羧基、羟基等功能基团；

(3)激活功能性纳米的功能基团；

(4)通过偶联剂与抗体共价结合，形成稳定的纳米探针；

优选地，所述一种多巯基修饰的共价偶联抗体的复合纳米粒子探针的制备过程中，对 Fe₂O₃/Au/Ag复合纳米粒子表面进行多巯基化合物修饰。