[发明专利]一种双分子荧光互补技术用于免疫诊断检测的方法

说明书

本发明涉及一种双分子荧光互补技术用于免疫诊断检测的方法，包括：两个互补的荧光蛋白片段、蛋白与抗体的连接肽、抗体和抗原待测物，首先将荧光蛋白按特定位点切开形成不发荧光的两个片段，通过基因重组技术，表达纯化含有连接序列的两个荧光蛋白片段，荧光蛋白N端片段与一抗体通过偶联剂相连，荧光蛋白C端片段与另一抗体通过偶联剂相连，在待测物存在情况下，两个抗体和待测物形成三元复合物，同时荧光蛋白N端片段和荧光蛋白C端片段靠近、互补，并重新形成有活性的荧光蛋白，通过检测荧光强度的变化，可判断目标待测物的量。此方法适用于抗体与抗原反应的免疫检测，可同时检测多种待测物，及时诊断多种疾病，在体外免疫诊断中具有巨大前景。

技术领域

本发明涉及一种双分子荧光互补技术用于体外免疫诊断检测的方法，属于疾病诊断检测领域。

背景技术

双分子荧光互补技术是一种以荧光蛋白为材料的片段互补系统。其基本原理是将荧光蛋白在合适的位点切开，成形成不发荧光的两个片段，这两个片段不能自发地组装成完整的荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发时不能产生荧光，但当这两个荧光片段分别连接到一组有相互作用的目标蛋白上，由于目标蛋白的相互作用，荧光蛋白的两个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，并在该荧光蛋白的激发光波长激发下，发射荧光。双分子荧光互补技术能够特异性的检测到蛋白的相互作用，是一种检测蛋白相互作用的简便、直观、灵敏的方法。

本发明提出的基于双分子荧光互补技术的免疫诊断检测方法是首先将荧光蛋白按特定位点切开形成不发荧光的两个片段，通过基因重组技术，表达纯化含有连接序列的两个荧光蛋白片段，得到的含有连接序列的荧光蛋白N端片段与一抗体通过偶联剂相连，含有连接序列的荧光蛋白C端片段与另一抗体通过偶联剂相连，在待测物存在情况下，两个抗体和待测物形成三元复合物，同时荧光蛋白N端片段和荧光蛋白C端片段靠近、互补，并重新形成具有活性的荧光蛋白，荧光蛋白活性由荧光强度所体现，待测物的含量与形成的荧光蛋白强度呈正相关。通过检测待测物的荧光强度，然后再通过标准曲线把信号转换成待测物的浓度，可判断目标待测物的量。此种技术方法适用于所有技术平台的抗体与抗原反应的免疫检测，不同的双分子荧光之间的光谱差异可用于同时检测多种待测物，及时诊断多种疾病，在体外免疫诊断中具有巨大应用前景。

目前，针对荧光免疫检测的方法，需要对抗原抗体反应液进行清洗，洗去未结合抗原的荧光标记抗体，由于清洗会造成试剂的精密度下降，而基于双分子荧光互补技术的免疫检测方法不需要对反应完成后的反应液进行清洗，从而能大大提高试剂的精密度和准确度。

在此之前，双分子荧光互补技术主要用于细胞内蛋白质之间的相互作用，用于免疫诊断的检测几乎空白，本发明首次提出了一种双分子荧光互补技术用于体外免疫诊断检测的方法，可快速、简便、准确地诊断相关疾病。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种双分子荧光互补技术用于体外免疫诊断检测的方法。

本发明所提供的免疫检测待测抗原的方法，具体可包括如下步骤：

(1)将荧光蛋白分成N端部分和C端部分：在所述N端部分的编码基因的5’或3’末端加上连接序列基因，形成含有连接序列的荧光蛋白N端片段；在所述C端部分的编码基因的5’或3’末端加上连接序列基因，形成含有连接序列的荧光蛋白C端片段；

其中，所述连接序列的加入是为了使荧光蛋白能够充分折叠。

(2)将所述含有连接序列的荧光蛋白N端和C端基因序列导入表达宿主，诱导表达纯化得到目的蛋白。

(3)将所述含有连接序列的荧光蛋白N端和C端通过戊二醛一步法或两步法、或EDC/NHS法、或过碘酸钠氧化法分别偶联到抗体上。