[发明专利]胶原蛋白7及相关方法

说明书

公开了制造胶原蛋白7或其功能性片段的方法，以及通过此种方法生产的胶原蛋白7和其功能性片段、编码胶原蛋白7和其功能性片段的核酸，以及包括此种核酸的载体和宿主细胞。

本申请是申请日为2012年8月3日、申请号为201280047084.3、发明名称为“胶原蛋白7及相关方法”的发明专利申请的分案申请。

本发明涉及胶原蛋白7、胶原蛋白7相关核酸和细胞及相关方法。

背景

胶原蛋白是加强和支持结缔组织，例如皮肤、腱、韧带和骨骼的蛋白质家族。胶原蛋白7作为锚原纤维的主要组分，其功能在于加强和稳定各种组织，包括皮肤(Ricard-Blum,Cold Spring Harb Perspect Biol 3(1):a004978(2011))。

胶原蛋白7合成为三条前-α1(Ⅶ)多肽链，该多肽链随后在内质网中经加工和折叠成三螺旋前胶原蛋白7蛋白质。前胶原蛋白7分泌到细胞外空间中，在那里它被进一步加工为成熟胶原蛋白7(Chung et al.Dermatol Clin 28(1):93-105(2010))。成熟胶原蛋白7经过多步骤的聚合过程以形成结构性锚原纤维(Fritsch et al.J Biol Chem 284(44):30248-30256(2009))。在皮肤中，发现这些锚原纤维在表皮基底膜带内，其是位于皮肤最上层、表皮和真皮底层之间的两层膜。在这里锚原纤维连接表皮基底膜至乳突真皮层。这种连接协助将皮肤的表皮和真皮层连接在一起，为皮肤提供构造和稳定性(Villone et al.JBiol Chem 283(36):24506-24513(2008))。

发明概述

在一个方面，公开的特征在于制造胶原蛋白7或其功能性片段的方法。该方法包括：

提供细胞，例如哺乳动物细胞，例如，CHO或HEK细胞，经基因修饰以表达胶原蛋白7或其功能性片段，和可选地，一种或多种多肽，例如，在细胞中提高胶原蛋白7产量的一种或多种多肽(例如，脯氨酸肽酶和/或脯氨酰羟化酶)；以及

在足够用于生产胶原蛋白7或其功能性片段的条件下培养所述细胞，从而制造胶原蛋白7或其功能性片段。

在一个实施方案中，胶原蛋白7是人胶原蛋白7。在一个实施方案中，胶原蛋白7由高甘氨酸密码子优化的序列所编码，例如，本文所描述的高甘氨酸密码子优化的序列。在一个实施方案中，胶原蛋白7具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列。在一个实施方案中，胶原蛋白7的氨基酸序列与SEQ ID NO 2至少80、90、95或99％相同。在一个实施方案中，胶原蛋白7的氨基酸序列与SEQ ID NO 2的不同不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述细胞经基因修饰以表达脯氨酸肽酶或其功能性片段，并且例如，所述脯氨酸肽酶可以是哺乳动物，例如人脯氨酸肽酶，或者啮齿动物，如小鼠、大鼠或仓鼠脯氨酸肽酶。在一个实施方案中，脯氨酸肽酶是：人脯氨酸肽酶，例如具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的人脯氨酸肽酶；具有与SEQ ID NO 4至少80、90、95或99％相同的氨基酸序列的脯氨酸肽酶；具有与SEQ ID NO 4的不同不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个残基的氨基酸序列的脯氨酸肽酶。

在一个实施方案中，所述细胞经基因修饰以表达脯氨酰羟化酶或其功能性片段，并且例如，所述脯氨酰羟化酶可以是哺乳动物，例如人脯氨酰羟化酶，或者啮齿动物，如小鼠、大鼠或仓鼠脯氨酰羟化酶。在一个实施方案中，脯氨酰羟化酶是：人脯氨酰羟化酶，例如具有SEQ ID NO X的氨基酸序列的人脯氨酰羟化酶；具有与SEQ ID NO X至少80、90、95或99％相同的氨基酸序列的脯氨酰羟化酶；具有与SEQ ID NO X的不同不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个残基的氨基酸序列的脯氨酰羟化酶。