[发明专利]检测AFB1的免标记便携式适配体传感器的制备方法

说明书

本发明提供了检测AFB1的免标记便携式适配体传感器的制备方法，属于电化学分析领域。包括如下步骤：磁性四氧化三铁纳米粒子(Fe₃O₄)的制备；金包四氧化三铁核‑壳结构磁性纳米粒子(Fe₃O₄@Au)的制备；核酸适配体修饰的Fe₃O₄@Au纳米生物探针的制备；丝网印刷电极的预处理；免标记便携式适配体传感器的构建；电化学交流阻抗法检测AFB1。本发明采用核酸适配体修饰的磁性壳核材料Fe₃O₄@Au对丝网印刷电极表面进行修饰，借助外加磁场作用将材料快速修饰在电极表面，操作简单，用时短；利用Au‑S键可更多、更牢固的将巯基化的适配体固定在电极表面，有效提高传感器的灵敏度。具有制备工艺简单，耗时短，试剂用量少，检测成本低廉等特点。

技术领域

本发明属于电化学分析领域，特点在于通过免标记的方法，实现对黄曲霉毒素B1的快速、灵敏检测。在技术上涉及纳米材料科学和生物传感等领域。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxin，简称AF)是由黄曲霉和寄生曲霉产生的一类代谢产物，目前已分离鉴定出了20余种，主要包括黄曲霉毒素B1(AFB1)、B2(AFB2)、M1(AFM1)、M2(AFM2)等亚型。其中，AFB1是目前发现的毒性最强的霉菌毒素，具有强烈的致癌、致畸、致突变性，其毒性是氰化钾的10倍、砒霜的68倍，致癌性是二甲基亚硝胺的75倍。因此，世界很多国家和组织都对农产品及食品中黄曲霉毒素制定了最高限量标准。联合国粮农组织规定食品中黄曲霉毒素最大允许量为总量(AFB1+AFB2+AFG1+AFG2)应小于15μg/kg(FAO，1995)。欧盟提出人类食用的花生及制品中AFB1的最大量不能超过2μg/kg(EC1881/2006)。我国对各类农产品和食品中黄曲霉毒素的含量也制定了一系列的限量标准(GB2761-2011)，其中，在花生、玉米及其制品中黄曲霉毒素的最大限量为20μg/kg，其他调味剂和发酵食品中的最大限量为5μg/kg，婴儿乳制品中最大限量为0.5μg/kg。

鉴于黄曲霉毒素的剧毒性和广泛存在性，发展和建立高效快速检测AFB1的方法具有非常重要的意义。薄膜层析法和液相色谱法是目前大部分检测机构都在使用的方法，这些方法可以实现灵敏度与特异性检测的要求，但由于其较长的检测周期，复杂的操作程序，而且需要较大的试剂用量，在很大程度上限制了这些方法的使用。免疫化学分析方法，包括放射免疫分析方法，酶联免疫吸附法和免疫层析法，这些方法也能够实现对黄曲霉毒素的定量检测，免疫分析法与传统的高效液相色谱法相比较，更加安全可靠，灵敏度也更高，但在检测过程中需要大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗体。然而，由于抗体的制备过程比较复杂，合成价格昂贵，且抗体稳定性差，易受外界环境影响而变性，不易存储等，使得免疫分析方法的推广应用受到限制。核酸适配体(apt)作为可替代抗体的一种新型识别元件，由一段寡核苷酸序列构成，它能与多种目标物高特异性、高选择性的结合。与抗体相比，核酸适配体不仅具有合成简单、易于储存和运输、化学性质稳定和方便再生等优点，还能够用氨基，巯基，荧光基团，生物素和酶等进行功能化，与电化学检测方法相结合，实现生物传感器便携化，而且操作简单，成本低。

本发明以金包四氧化三铁结构磁性纳米粒子(Fe₃O₄@Au NPs)修饰的丝网印刷碳电极(SPCE)为传感平台，以核酸适配体为识别元件，构建了一种快速、灵敏检测AFB1的免标记便携式适配体传感器；通过建立了AFB1标准品浓度与电化学阻抗值之间的对应关系，实现简单、灵敏、快速检测AFB1的目的。

发明内容

本发明旨在提供一种免标记、操作简单、灵敏度高、选择性好等优点为一体的便携式适配体传感器。所构建的传感器制备工艺简单，检测成本低，可以实现灵敏、快速定量检测AFB1的目的。