[发明专利]一种可诱导鱼类雌核发育的失活精子液的制备方法

权利要求书

1.一种可诱导鱼类雌核发育的失活精子液的制备方法,其特征在于：

1）亲鱼选择

选择体质健壮、无病无伤、达性成熟年龄的雄性亲鱼；

2）催产排精：

首先将雄性亲鱼用10 ～ 20 mg /L 的高锰酸钾水溶液进行1 ～1.5小时的鱼体消毒，之后采用二次注射法进行催产排精，第一次用2μg促黄体素释放激素类似物预备针注射雄性亲鱼；16小时后，按照每kg鱼重注射3～5mg复配催熟剂进行第二次注射；

3）精子处理液制备

采集雄性亲鱼精液，按精液：精子稀释液为1：5的体积比配成精子处理液，备用；所述的精子稀释液，其配方为：NaCl 2.5～4.0g，KCl 1.0～1.6g，CaCl2 0.1～0.2g，MgSO2.7H2O0.1～0.2g，NaHCO3 0.2～0.4g，无菌水定容至500ml，即配即用；

4）精子失活处理

利用常压室温等离子体作为鱼类精子的灭活剂，通过育种机AＲTP对精子处理液进行精子AＲTP失活处理；AＲTP失活处理条件为：上样量为20μL精子处理液，处理输出功率为125 W、气体流速为10 L·min^{－ 1}，辐照距离为2 mm，处理时间为20～60 s；

在AＲTP处理后的精子处理液中，加入5μL 0.6M 甘露醇、10μL Hank's 液,随后用玻璃棒蘸取加甘露醇、Hank's 液的精子处理液，滴在载玻片上，加上盖玻片，在显微镜下用暗视野进行观察，此时可观察到精子活力下降，80～90%的精子处于慢速运动即非直线前进运动状态，得到失活精子液；

5）失活精子的保存

取30μL失活精子液，加入25μL的0.2M 三磷酸腺苷、5μL 30%甘油溶液，混合后储存于冰块中，供于雌核发育的卵子进行受精备用。

2.根据权利要求1所述的一种可诱导鱼类雌核发育的失活精子液的制备方法，其特征在于所述的复配催熟剂，其配方为每10mg复配催熟剂中含有2mg地欧酮、6mg 鲤鱼脑垂体、800国际单位IU人绒毛膜促性腺激素。