[发明专利]一种牛干扰素α生物学活性检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种牛干扰素α生物学活性检测方法，属于干扰素活性检测技术领域。

背景技术

干扰素(IFN)是细胞和机体受到病毒感染，或者受核酸、细菌内毒素和促细胞分裂素等的作用后，由受体细胞分泌的一种广谱抗病毒糖蛋白。根据干扰素的来源和理化性质，可将其分为I型、II型和III干扰素。I型干扰素包括IFN-α，IFN-β，和IFN-τ；II型干扰素即IFN-γ；III干扰素即IL-28A，IL-28B和IL-29。

IFN-α有四个主要功能。第一，可以使感染病毒的细胞及其周围细胞进入内源性抗病毒状态，限制病毒的传播；第二，维持天然免疫反应处于平衡状态，促进抗原递呈和NK细胞功能的同时抑制促炎信号通路和细胞因子的产生；第三，激活获得性免疫系统，促进高亲和力抗原特异性T细胞的产生，促进B细胞反应和免疫记忆；第四，具有抑制病毒增殖的作用。

IFN-α的作用机制在25年前已经阐明，IFN与受体结合激活受体相关JAK1和TYK2，使STAT1和STAT2络氨酸磷酸化，磷酸化的STAT1和STAT2形成二聚体并转移入核，装配IFN调节因子9(IRF9)形成3聚体的IFN刺激因子3(ISGF3)。ISGF3与其同源DNA序列(IFN刺激反应元件，ISREs)结合，直接激活ISGs转录，使宿主细胞进入抗病毒状态。ISG抑制病毒的途径主要有，抑制病毒的转录、翻译和核酸复制；降解病毒核酸；改变宿主细胞脂代谢。因此，只要检测到ISGs的启动子活性增加就可以直接反应IFN-α的生物学活性。

IFN-α可以经JAK-STAT信号转导途径激活Mx启动子(Mx promoter，Mxp)，促进Mx的表达，Mx能够抑制负链RNA病毒复制。在牛中存在Mx和Mx2两种蛋白，其中Mx起主要作用。Mxp有较好的专一性，它不能被白细胞介素和肿瘤坏死因子等其它细胞因子启动，能够准确反应IFN-α生物学功能。

目前检测干扰素生物学活性主要有3种方法：病毒复制抑制、噬斑减少分析和细胞病变抑制。但这3种方法都容易产生较大误差，重复性不好，准确度低。最近Mxp-Luciferase(荧光素酶)系统已经开始用于I型干扰素生物学活性检测，该系统检测的是IFN激活Mxp的能力，不存在假阳性；整个过程完全避免VSV等活病毒的使用，没有生物安全的顾虑；检测程序简化，时间大大缩短，在IFN处理细胞后约6h即可完成检测，检测速度快；荧光素酶的表达可以通过仪器检测精确量化，不仅提高了IFN定量的准确性，更便于大量样品的高通量操作。但该方法基于质粒瞬时转染为基础，每次需要准备内参照质粒，并保证质粒转染效率一致才能够得到准确的检测结果，因此在一般实验室很难开展，而且需要使用荧光素酶底物，增加了使用成本。

发明内容

鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提供一种利用绿色荧光蛋白(EGFP)的牛干扰素α生物学活性检测方法，该方法不需要内参照质粒，能够简化检测过程，不需要重复进行质粒转染，提高准确性和重复性，实用性更强。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现：

一种牛干扰素α生物学活性检测方法，其包括以下步骤：

采用PCR扩增获取牛Mx蛋白的Mxp的基因片段；

用PCR扩增获得的牛Mx蛋白的Mxp的基因片段通过T4DNA连接酶替换原pEGFP-N1载体质粒中的pCMV的基因片段，构建pEGFP-N1-Mxp质粒；

用pEGFP-N1-Mxp质粒转染细胞，并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株；

对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养；

以梯度稀释的牛干扰素α标准品制备标准曲线，确定干扰素效价与荧光值之间的数学逻辑关系；

将待检牛干扰素α样品加入克隆化培养后的细胞中，然后检测荧光强度，结合标准曲线评价待检牛干扰素α样品的效价。

上述的牛干扰素α生物学活性检测方法中，将待检牛干扰素α样品加入克隆化培养后的细胞中，需要孵育一定的时间，一般6小时左右。

上述的牛干扰素α生物学活性检测方法中，在稳定转染细胞株中加入牛干扰素α，会激活Mx基因启动子活性促进细胞内EGFP的表达，通过激发光源照射后细胞发出荧光的强度与牛干扰素α的生物学活性呈正相关，因此可以定量评价牛干扰素α的生物学活性。

本发明中，Mxp是指牛Mx基因启动子区域，pCMV是指pEGFP-N1质粒的CMV启动子区域。

上述的牛干扰素α生物学活性检测方法中，优选的，采用PCR扩增获取牛Mx蛋白的Mxp的基因片段的步骤包括：