[发明专利]一种蜘蛛丝蛋白骨钉及其制备方法

权利要求书

1.一种蜘蛛丝蛋白骨钉制备方法，其特征在于，所述蜘蛛丝蛋白骨钉制备方法包括以下步骤：

(1)制备蜘蛛丝蛋白溶液；

所述蜘蛛丝蛋白为基因重组蜘蛛丝蛋白，所述步骤(1)包括：

将表达基因重组蜘蛛丝蛋白的工程菌置于第一浓度Tris-HCl(PH＝8)/NaCl/Imidazole溶液中，并进行菌体破碎处理，得到第一混合液；所述第一浓度Tris-HCl(PH＝8)/NaCl/Imidazole溶液中，Tris-HCl浓度范围为5-50mM，NaCl浓度范围为50～200mM，Imidazole浓度范围为1-10mM；

将第一混合液离心，取上清液，获得第一上清液；

将第一上清液在60～80℃恒温水浴中保持预设时间，离心，取上清液，获得第二上清液；

将第二上清液加入镍层析柱，使用第二浓度Tris-HCl(PH＝8)/NaCl/Imidazole溶液去除杂质蛋白，然后使用第三浓度Tris-HCl(PH＝8)/NaCl/Imidazole溶液洗脱，获得基因重组蜘蛛丝第一初始溶液；所述第二浓度Tris-HCl(PH＝8)/NaCl/Imidazole溶液中，Tris-HCl浓度范围为5-50mM，NaCl浓度范围为50～200mM，Imidazole浓度范围为40-60mM；所述第三浓度Tris-HCl(PH＝8)/NaCl/Imidazole溶液中，Tris-HCl浓度范围为5-50mM，NaCl浓度范围为50～200mM，Imidazole浓度范围为200-300mM；

对所述基因重组蜘蛛丝蛋白洗脱液进行透析，获得基因重组蜘蛛丝第二初始溶液；

将基因重组蜘蛛丝第二初始溶液离心，去上清液，得到基因重组蜘蛛丝蛋白第三初始溶液；

将所述基因重组蜘蛛丝蛋白第三初始溶液干燥，得到无水基因重组蜘蛛丝蛋白；所述基因重组蜘蛛丝蛋白第三初始溶液干燥的步骤包括：将所述基因重组蜘蛛丝蛋白第三初始溶液在-80～0℃的环境中冷冻；在冷冻干燥机中真空冷冻处理1～500小时；其中，所述冷冻干燥机的真空压强为0.001～1mBar，温度为-80～0℃；

将所述无水基因重组蜘蛛丝蛋白溶于溶剂，获得所述蜘蛛丝蛋白溶液；所述蜘蛛丝蛋白溶液为蜘蛛丝蛋白六氟异丙醇HFIP溶液或蜘蛛丝蛋白水溶液；

所述步骤(1)包括：将1重量份的无水基因重组蜘蛛丝蛋白溶于0.5～10重量份的六氟异丙醇或1～10重量份的水，获得所述蜘蛛丝蛋白溶液；其中，所述无水基因重组蜘蛛丝蛋白和所述六氟异丙醇的温度为5～50℃，所述无水基因重组蜘蛛丝蛋白和所述水的温度为5～50℃；

(2)将所述蜘蛛丝蛋白溶液注入模具，甲醇或乙醇处理和干燥，获得蜘蛛丝蛋白骨钉；

所述步骤(2)中，经所述甲醇或乙醇处理和干燥后，获得蜘蛛丝蛋白棒材；再将所述蜘蛛丝蛋白棒材切屑获得蜘蛛丝蛋白骨钉。

2.根据权利要求1所述的蜘蛛丝蛋白骨钉制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述甲醇处理包括：将注有所述蜘蛛丝蛋白溶液的模具浸没于液态甲醇中，并每隔1～50小时更换一次甲醇溶液，更换次数为1～50次，获得蜘蛛丝蛋白固体；将所述蜘蛛丝蛋白固体从所述模具中取出并继续使用甲醇浸泡，并每隔1～50小时更换一次甲醇溶液，更换次数为1～50次；

在所述步骤(2)中，所述乙醇处理包括：将注有所述蜘蛛丝蛋白溶液的模具浸没于液态乙醇中，并每隔1～50小时更换一次乙醇溶液，更换次数为1～50次，获得蜘蛛丝蛋白固体；将所述蜘蛛丝蛋白固体从所述模具中取出并继续使用乙醇浸泡，并每隔1～50小时更换一次乙醇溶液，更换次数为1～50次。

3.根据权利要求1所述的蜘蛛丝蛋白骨钉制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述干燥包括：通风环境下使蜘蛛丝蛋白中的甲醇或乙醇挥发并风干，所述通风环境温度为10～50℃。

4.根据权利要求1所述的蜘蛛丝蛋白骨钉制备方法，其特征在于，还包括：(3)将步骤(2)获得的蜘蛛丝蛋白骨钉在活性药物溶液中浸泡，获得含有所述活性药物的蜘蛛丝蛋白骨钉；其中，所述活性药物溶液中的药物浓度为0.001μg/mL～5mg/mL，浸泡时间为1分钟～500小时。