[发明专利]抗八种三嗪类农药的群选性单克隆抗体制备及其应用

说明书

本发明公开了一种抗八种三嗪类农药的群选性单克隆抗体制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明通过在1，3，5‑三嗪环上引入合适的活性手臂，制备免疫半抗原和包被半抗原，活性酯法分别偶联鸡卵白蛋白(OVA)和牛血清蛋白(BSA)制备免疫原和包被原，用免疫原免疫Balb/c鼠，通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，基于该抗体，以包被原作为检测抗原，建立了异源的间接竞争酶联免疫分析方法(ELISA)，可用于检测包括扑草净、扑灭通、叠氮津、仲丁通、莠去通、敌草净、西草净、莠灭净在内的八种三嗪类农药，该方法的检测成本低，灵敏度高，操作简便，适用于该八种三嗪类农药的现场快速大量筛查。

技术领域

本发明涉及抗八种三嗪类农药的群选性单克隆抗体的制备方法及其在酶联免疫分析方法中的应用，适用于包括扑草净、扑灭通、叠氮津、仲丁通、莠去通、敌草净、西草净、莠灭净在内的八种三嗪类农药的现场快速筛查，属于农药残留快速检测领域。

背景技术

我国农业生产持续、稳定增长，与此同时，化肥、化学农药、除草剂等农用化学品的长期、大量、不合理使用，对我国农业生态环境和农畜产品的安全生产及人体健康与生命构成了严重威胁，由农药残留引起人畜中毒死亡事件频繁发生。我国蔬菜、茶叶出口中每年因农药残留超标而被进口国拒收、扣留、索赔、终止合同、拒绝入关等事件时有发生，给国家带来巨大的经济损失并丢失了国际市场，有损国家形象。

三嗪类农药是一类传统的高选择性除草剂，早在上世纪50年代便开始在世界范围内登记使用，年销售额过亿。其主要通过抑制光合作用而控制杂草的生长，被广泛用于农业生产过程的化学除草。然而，该类除草剂有类似苯环的结构，化学性质稳定，半衰期长，不易降解，能长期存在并富集于被施用对象中，造成环境、土壤和农产品污染，对人类健康造成严重威胁，如损伤人体免疫、如损害人体免疫、干扰内分泌系统、引发癌症及先天性缺陷等。

传统的检测三嗪类农药的方法有液相色谱法、液质联用法等，虽然以上方法准确、灵敏度高，但需要的仪器设备昂贵，并且操作复杂，对操作人员的要求较高，且限于专业实验室内使用。近年来，酶联免疫分析方法(ELISA)因其特异性强、灵敏度高、操作简便、低成本且适用于现场大批量样品快速检测的特点，逐渐成为农药残留快速检测的热点。

虽然三嗪类农药抗体及相关免疫分析方法已有报道，但多数围绕莠去津及其他氯代的三嗪类农药进行研究，对硫代和氧代的三嗪农药研究较少，针对扑草净、扑灭通、叠氮津、仲丁通、莠去通、敌草净、西草净、莠灭净的群选性单克隆抗体及酶联免疫分析方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于八种三嗪类农药(扑草净、扑灭通、叠氮津、仲丁通、莠去通、敌草净、西草净、莠灭净)检测的群选性单克隆抗体，以及建立一种简单且具高灵敏度的检测三嗪类农药的异源间接竞争ELISA方法，该方法可用于环境及农产品中三嗪类农药残留的灵敏快速检测。其优点在于不需要昂贵的大型分析仪器，使用简便，通过阅读说明书，非专业人员即可进行操作，并且检测快速，大大增加了三嗪类农药检测的筛查效率和普及程度，具有广阔的开发前景。

本发明获得了能够产生特异性识别八种三嗪类农药的群选性单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株TZ5E4，此细胞株已于2017年11月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCCNo.14732；此外，本发明通过合成包被抗原，建立了异源的间接竞争ELISA方法，是一种针对该八种三嗪类农药的高灵敏度及高通量的检测系统。

技术方案：

1.抗八种三嗪类农药的杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC No.14732。

2.抗八种三嗪类农药的群选性单克隆抗体，有保藏号为CGMCC No.14732的杂交瘤细胞株所分泌，所述单克隆抗体命名为TZ5E4。

3.本发明所述的抗八种三嗪类农药的群选性单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：